峨眉金線蓮的組培快繁方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種可提高移栽成活率和增殖系數(shù)，并且可以保持峨眉金線蓮優(yōu)良性狀和藥性的金線蓮組培快繁方法，屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法先選取生長(zhǎng)在5～10月份的野生峨眉金線蓮，制作外植體并進(jìn)行消毒處理，然后通過(guò)叢生芽的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、生根壯苗培養(yǎng)和移栽溫室大棚培養(yǎng)的措施，通過(guò)激素誘導(dǎo)使金線蓮快速繁殖。本發(fā)明方法，可以保持峨眉金線蓮的優(yōu)良性狀，保持其優(yōu)良的藥性，且方法簡(jiǎn)單、成本低，可以實(shí)現(xiàn)工廠化育苗。采用本方法誘導(dǎo)出叢生芽并生根的比例達(dá)90%以上，移栽成活率在95%以上，在4個(gè)月內(nèi)增殖系數(shù)可以達(dá)到8-10倍。通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的峨眉金線蓮，不變異，產(chǎn)量高，成本低，周期短，具較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】峨眉金線蓮的組培快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種可提高移栽成活率和增殖系數(shù)，并且可以保持蛾眉金線蓮優(yōu)良性狀和藥性的金線蓮組培快繁方法。
【背景技術(shù)】 [0002]蛾眉金線蓮(AnoectochilusemeiensisK.Y.Lang.)是蘭科(Orchidaceae)、開(kāi)唇蘭屬(Anoectochilus)多年生草本植物，同花葉開(kāi)唇蘭、臺(tái)灣金線蓮、福建金線蓮等統(tǒng)稱(chēng)為金線蓮。在民間常作藥用，其氨基酸組成、成分、含量及維生素、多糖等含量均高于西洋參和野山參。其性平味甘，具有清熱、涼血、祛風(fēng)利濕、強(qiáng)心利尿、固腎平肝以及降血壓等功效，在治療肝病、高血壓、糖尿病及腫瘤等方面有良好的效果。另外，金線蓮也是觀賞價(jià)值極高的觀賞植物。
[0003]但是，由于金線蓮屬植物的種子微小，不具胚乳，無(wú)發(fā)芽能力，只有與真菌共生的情況下才能萌發(fā)，因此，發(fā)芽率低，野外生長(zhǎng)條件苛刻，自然繁殖和生長(zhǎng)緩慢。另外由于蛾眉金線蓮的生境地破壞嚴(yán)重，野生蛾眉金線蓮資源非常稀少，現(xiàn)已瀕臨滅絕。
[0004]為此研究蛾眉金線蓮的人工培養(yǎng)技術(shù)，建立一套種苗的組織培養(yǎng)快繁體系，對(duì)合理保護(hù)開(kāi)發(fā)蛾眉金線蓮資源并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；兄种匾淖饔?。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可提高移栽成活率和增殖系數(shù)的蛾眉金線蓮組培快繁方法，使種苗生產(chǎn)能滿足規(guī)模生產(chǎn)的需要。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:蛾眉金線蓮的組培快繁方法，包括如下步驟:
[0007]a、選取生長(zhǎng)在5~10月份的蛾眉野生金線蓮，除去根和葉，將莖切成帶腋芽或頂芽的段狀作為外植體材料，外植體進(jìn)行消毒處理；
[0008]b、叢生芽的誘導(dǎo):將消毒后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+蔗糖25~35g/L +瓊脂6~10g/L +活性炭1.5~2.5g/L + I~2mg/L6-BA + 0.3 ~0.7mg/LNAA, pH 值為 5.6 ~6.0 ;培養(yǎng)周期為 30 ~40 天；
[0009]C、繼代培養(yǎng)；
[0010]d、生根壯苗培養(yǎng)；
[0011]e、移栽溫室大棚培養(yǎng)。
[0012]其中，在具體實(shí)施時(shí)，步驟a中外植體的長(zhǎng)度為0.5cm比較合適。繼代培養(yǎng)次數(shù)5~10次比較合適。
[0013]其中，上述方法步驟c中繼代培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基與步驟b中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。
[0014]其中，上述方法步驟d中生根壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖25~35g/L +瓊脂 6 ~10g/L + 活性炭 1.5 ~2.5g/L + 0.3 ~0.7mg/LNAA + 0.15 ~0.25mg/L6-BA, pH 值為 5.6 ~6.0。
[0015]其中，上述方法步驟d中生根壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L +瓊脂 8g/L + 活性炭 2.0g/L + 0.5mg/LNAA + 0.2mg/L6_BA，pH 值為 5.8。
[0016]其中，上述方法步驟b中誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L +瓊脂8g/L +活性炭 2.0g/L + 1.5mg/L6-BA + 0.5mg/LNAA, pH 值為 5.8。
[0017]其中，上述方法步驟e移栽溫室大棚培養(yǎng)是指生根壯苗培養(yǎng)后，煉苗7天，組培苗長(zhǎng)至4~5cm高時(shí)移栽至人工大棚，移栽用介質(zhì)為泥炭土加少量珍珠巖的混合物。
[0018]其中，上述方法步驟a所述消毒處理是指將外植體用自來(lái)水沖洗2~3小時(shí)，然后用軟毛刷清洗，用蒸餾水沖洗，置超凈工作臺(tái)內(nèi)，75%酒精浸泡30秒，無(wú)菌水清洗干凈，0.1%的升汞溶液中表面消毒15分鐘，無(wú)菌水清洗4-5次，每次2分鐘。
[0019]其中，上述方法步驟b、c和d都在培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室條件為:光照強(qiáng)度為20001ux, 16h/d,培養(yǎng)溫度為22~25°C ;每?jī)蓚€(gè)月對(duì)培養(yǎng)室定期消毒。
[0020]其中，上述方法步驟e所述溫室大棚采用透光率50%遮蔭網(wǎng)遮蔭，溫室大棚中溫度控制在20~32°C，相對(duì)濕度控制在65~75%。
[0021]其中，上述方法步驟a中所述金線蓮是指生長(zhǎng)在蛾眉山地區(qū)的蛾眉金線蓮。
[0022]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明是通過(guò)激素誘導(dǎo)蛾眉金線蓮的腋芽或頂芽產(chǎn)生叢生芽進(jìn)行快速繁殖來(lái)實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基的篩選，發(fā)現(xiàn)了特別適合蛾眉金線蓮種苗培育的培養(yǎng)基，增殖系數(shù)(即增殖倍數(shù)`)達(dá)8-10倍，移栽成活率在95%以上，以此可實(shí)現(xiàn)商品化規(guī)模種植。
[0023]本發(fā)明組培快速繁殖的方法，可以保持蛾眉金線蓮的優(yōu)良性狀，保持其優(yōu)良的藥性，且方法簡(jiǎn)單易行，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)工廠化育苗。采用本方法誘導(dǎo)出叢生芽并生根的比例達(dá)90%以上，移栽成活率在95%以上，在4個(gè)月內(nèi)增殖系數(shù)可以達(dá)到8-10倍。通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛾眉金線蓮，不變異，產(chǎn)量高，成本低，周期短，具較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
【具體實(shí)施方式】
[0024]本發(fā)明具體可以按照以下方式實(shí)施，蛾眉金線蓮的組培快繁方法，包括如下步驟:
[0025]a、選取生長(zhǎng)在5~10月份的野生蛾眉金線蓮，除去根和葉，將莖切成帶腋芽或頂芽的段狀作為外植體材料，外植體用自來(lái)水沖洗2~3小時(shí)，然后用軟毛刷清洗，用蒸餾水沖洗，置超凈工作臺(tái)內(nèi)，75%酒精浸泡30秒，無(wú)菌水清洗干凈，0.1%的升汞溶液中表面消毒15分鐘，無(wú)菌水清洗4-5次，每次2分鐘；
[0026]b、叢生芽的誘導(dǎo):將消毒后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+蔗糖25~35g/L +瓊脂6~10g/L +活性炭1.5~2.5g/L + I~2mg/L6-BA + 0.3 ~0.7mg/LNAA, pH 值為 5.6 ~6.0 ;培養(yǎng)周期為 30 ~40 天；
[0027]C、繼代培養(yǎng)5~10次；培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+蔗糖25~35g/L +瓊脂6~IOg/L + 活性炭 1.5 ~2.5g/L + I ~2mg/L6-BA + 0.3 ~0.7mg/LNAA, pH 值為 5.6 ~6.0 ;培養(yǎng)周期為30~40天；
[0028]d、生根壯苗培養(yǎng)；培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖25~35g/L+瓊脂6~10g/L +活性炭 1.5 ~2.5g/L + 0.3 ~0.7mg/LNAA + 0.15 ~0.25mg/L6_BA，pH 值為 5.6 ~6.0 ;[0029]e、移栽溫室大棚培養(yǎng):生根壯苗培養(yǎng)后，煉苗7天，組培苗長(zhǎng)至4~5cm高時(shí)移栽至人工大棚，移栽用介質(zhì)為泥炭土加少量珍珠巖的混合物。
[0030]本發(fā)明所述的MS培養(yǎng)基即為常規(guī)的MS培養(yǎng)基或常規(guī)方法配制的MS培養(yǎng)基。1/2MS培養(yǎng)基:無(wú)機(jī)鹽為MS培養(yǎng)基的一半。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明步驟b、c和d采用的培養(yǎng)基都是通過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基)配加蔗糖、瓊脂、活性炭等配制得到，上述各物質(zhì)的含量都是配制完成后各物質(zhì)質(zhì)量所占總體積的含量。其中，瓊脂是以藻類(lèi)的石花菜屬(Gelidium)及江蘺屬(Gracilaria)制成的膠產(chǎn)品，為培養(yǎng)基的固化劑。6-BA即是6-芐氨基腺嘌呤，分子式:C12H11N5。NAA即是萘乙酸，英文通用名1-naphthlceticacid,其他名稱(chēng) a_ 蔡乙酸。
[0031]優(yōu)選的，上述方法步驟d中生根壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L +瓊脂 8g/L + 活性炭 2.0g/L + 0.5mg/LNAA + 0.2mg/L6_BA，pH 值為 5.8。
[0032]優(yōu)選的，上述方法步驟b和c采用的培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L +瓊脂8g/L + 活性炭 2.0g/L + 1.5mg/L6-BA + 0.5mg/LNAA, pH 值為 5.8。
[0033]其中，上述方法步驟b、c和d都在培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選培養(yǎng)室條件為:光照強(qiáng)度為20001ux，16h/d,培養(yǎng)溫度為22~25°C ;每?jī)蓚€(gè)月對(duì)培養(yǎng)室定期消毒。
[0034]優(yōu)選的，上述方法步驟e所述溫室大棚采用透光率50%遮蔭網(wǎng)遮蔭，溫室大棚中溫度控制在20~32°C，相對(duì)濕度控制在65~75%。
[0035]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此將本發(fā)明的保護(hù)范圍限制在實(shí)施例之中。
[0036]實(shí)施例一
[0037]材料蛾眉金線蓮，采自四川蛾眉山。按以下步驟繁殖蛾眉金線蓮。
[0038]1、取野生蛾眉金線蓮植株，切下長(zhǎng)0.5cm含有一個(gè)腋芽的小段。
[0039]2、自來(lái)水沖洗2-3小時(shí)，軟毛刷清洗干凈，蒸餾水沖洗干凈，置超凈工作臺(tái)內(nèi)，75%酒精浸泡30秒，無(wú)菌水清洗干凈，0.1%的升汞溶液中表面消毒15分鐘，無(wú)菌水清洗4-5次，每次2分鐘。
[0040]3、消毒后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 8g/L+ 活性炭 2.0g/L+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA, pH 值為 5.8 ;培養(yǎng)周期為30-40天；培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為20001ux，16h/d,培養(yǎng)溫度為22_25°C。培養(yǎng)7天左右開(kāi)始萌發(fā)，當(dāng)叢生芽萌發(fā)至0.5cm長(zhǎng)時(shí)，將其剖開(kāi)，轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件同叢生芽誘導(dǎo)，2個(gè)月后增殖系數(shù)為3-4。
[0041]4、當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至Icm長(zhǎng)時(shí)，單株轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，生根壯苗培養(yǎng)基成分為:1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+活性炭2.0g/L+0.5mg/LNAA+0.2mg/L6-BA, pH值為5.8 ;培養(yǎng)條件同叢生芽誘導(dǎo)(光照強(qiáng)度為20001ux，16h/d，培養(yǎng)溫度為22-250C )。生根培養(yǎng)50-60天，生根率可達(dá)95%以上，長(zhǎng)4_5cm左右。
[0042]5、煉苗7天后移栽至人工大棚，大棚50%遮蔭網(wǎng)遮蔭，培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭土加少量珍珠巖的混合物。移栽后每天澆水3次，澆至培養(yǎng)基質(zhì)濕透為止(使植株周?chē)鷿穸?0%左右)，每半月施復(fù)合肥一次(常見(jiàn)蔬菜專(zhuān)用肥:氮15%、五氧化二磷7%和氧化鉀8%)，并注意防治病蟲(chóng)害。[0043]本次繁殖得到的蛾眉金線蓮在4-5個(gè)月內(nèi)通過(guò)叢生芽的誘導(dǎo)及繼代、生根壯苗等步驟，誘導(dǎo)出叢生芽并生根的比例達(dá)90%以上，移栽后成活率在95%以上，在4個(gè)多月內(nèi)增殖系數(shù)可達(dá)8-10，長(zhǎng)5cm左右，且通過(guò)本實(shí)施例生產(chǎn)的蛾眉金線蓮，不變異，產(chǎn)量高，成本低，大大提高了蛾眉金線蓮的數(shù)量。
[0044]實(shí)施例二
[0045]材料蛾眉金線蓮，采自四川蛾眉山。按以下步驟繁殖蛾眉金線蓮。
[0046]1、取野生蛾眉金線蓮植株，切下長(zhǎng)0.5cm含有一個(gè)頂芽的小段。
[0047]2、自來(lái)水沖洗2-3小時(shí)，軟毛刷清洗干凈，蒸餾水沖洗干凈，置超凈工作臺(tái)內(nèi)，75%酒精浸泡30秒，無(wú)菌水清洗干凈，0.1%的升汞溶液中表面消毒15分鐘，無(wú)菌水清洗4-5次，每次2分鐘。
[0048]3、消毒后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 8g/L+ 活性炭 2.0g/L+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA, pH 值為 5.8 ;培養(yǎng)周期為30-40天；培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度為20001ux，16h/d,培養(yǎng)溫度為22_25°C。培養(yǎng)7天左右開(kāi)始萌發(fā)，當(dāng)叢生芽萌發(fā)誘導(dǎo)產(chǎn)生2-4個(gè)左右并約有0.5cm長(zhǎng)的新芽時(shí)，將其剖開(kāi)，轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件同叢生芽誘導(dǎo)，2個(gè)月后增殖系數(shù)為3-4。
[0049]4、當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至Icm長(zhǎng)時(shí)，單株轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，生根壯苗培養(yǎng)基成分為:1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+活性炭2.0g/L+0.5mg/LNAA+0.2mg/L6-BA, pH值為5.8 ;培 養(yǎng)條件同叢生芽誘導(dǎo)(光照強(qiáng)度為20001ux，16h/d，培養(yǎng)溫度為22-250C )。生根培養(yǎng)50-60天，生根率可達(dá)95%以上，長(zhǎng)4_5cm左右。
[0050]5、煉苗7天后移栽至人工大棚，大棚50%遮蔭網(wǎng)遮蔭，培養(yǎng)基質(zhì)為泥炭土加少量珍珠巖的混合物。移栽后每天澆水3次，澆至培養(yǎng)基質(zhì)濕透為止(使植株周?chē)鷿穸?0%左右)，每半月施復(fù)合肥一次(常見(jiàn)蔬菜專(zhuān)用肥:氮15%、五氧化二磷7%和氧化鉀8%)，并注意防治病蟲(chóng)害。
[0051]本次繁殖得到的蛾眉金線蓮在4-5個(gè)月內(nèi)通過(guò)叢生芽的誘導(dǎo)及繼代、生根壯苗等步驟，誘導(dǎo)出叢生芽并生根的比例達(dá)90%以上，移栽后成活率在95%以上，在4-5個(gè)月內(nèi)增殖系數(shù)可以達(dá)到8-10倍。且通過(guò)本實(shí)施例生產(chǎn)的蛾眉金線蓮，不變異，產(chǎn)量高，成本低，大大提高了蛾眉金線蓮的育苗生產(chǎn)能力。
【權(quán)利要求】
1.蛾眉金線蓮的組培快繁方法，其特征在于包括如下步驟: a、選取生長(zhǎng)在5~10月份的野生蛾眉金線蓮，除去根和葉，將莖切成帶腋芽或頂芽的段狀作為外植體材料，外植體進(jìn)行消毒處理； b、叢生芽的誘導(dǎo):將消毒后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+蔗糖25~35g/L +瓊脂6~10g/L +活性炭1.5~2.5g/L + I~2mg/L6_BA +0.3~0.7mg/LNAA, pH值為5.6~6.0 ;培養(yǎng)周期為30~40天； C、繼代培養(yǎng)； d、生根壯苗培養(yǎng)； e、移栽溫室大棚培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛾眉金線蓮的組培快繁方法，其特征在于:步驟c中繼代培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基與步驟b中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛾眉金線蓮的組培快繁方法，其特征在于:步驟d中生根壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖25~35g/L +瓊脂6~10g/L +活性炭1.5~2.5g/L + 0.3 ~0.7mg/LNAA + 0.15 ~0.25mg/L6_BA，pH 值為 5.6 ~6.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛾眉金線蓮的組培快繁方法，其特征在于:步驟d中生根壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L +瓊脂8g/L +活性炭2.0g/L + 0.5mg/LNAA + 0.2mg/L6-BA, pH 值為 5.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛾眉金線蓮的組培快繁方法，其特征在于:步驟b中誘導(dǎo)培養(yǎng)基為=MS 培養(yǎng)基+ 蔗糖 30g/L +瓊脂 8g/L + 活性炭 2.0g/L + 1.5mg/L6_BA + 0.5mg/LNAA, pH 值為 5.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的蛾眉金線蓮的組培快繁方法，其特征在于:步驟e移栽溫室大棚培養(yǎng)是指生根壯苗培養(yǎng)后，煉苗7天，組培苗長(zhǎng)至4~5cm高時(shí)移栽至人工大棚，移栽用介質(zhì)為泥炭土加少量珍珠巖的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的蛾眉金線蓮的組培快繁方法，其特征在于:步驟a所述消毒處理是指將外植體用自來(lái)水沖洗2~3小時(shí)，然后用軟毛刷清洗，用蒸餾水沖洗，置超凈工作臺(tái)內(nèi)，75%酒精浸泡30秒，無(wú)菌水清洗干凈，0.1%的升汞溶液中表面消毒15分鐘，無(wú)菌水清洗4-5次，每次2分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的蛾眉金線蓮的組培快繁方法，其特征在于:步驟b、c和d都在培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室條件為:光照強(qiáng)度為20001uX，16h/d,培養(yǎng)溫度為22~25°C ;每?jī)蓚€(gè)月對(duì)培養(yǎng)室定期消毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的蛾眉金線蓮的組培快繁方法，其特征在于:步驟e所述溫室大棚采用透光率50%遮蔭網(wǎng)遮蔭，溫室大棚中溫度控制在20~32°C，相對(duì)濕度控制在65~75%。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103688854SQ201310655251
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】魯松, 熊鐵一 申請(qǐng)人:四川省自然資源科學(xué)研究院, 峨眉山生物資源實(shí)驗(yàn)站