利用玉米異源多倍體培育非整倍體多年生飼草品種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用玉米異源多倍體培育非整倍體多年生飼草品種的方法，屬于玉米遠(yuǎn)緣雜交領(lǐng)域。本發(fā)明以四川農(nóng)業(yè)大學(xué)育成的MTF-1（Tripsazea?creammaizeT.2n=76）為母本，以大芻草為父本雜交，然后對雜交后代從多年生、越冬性、分蘗數(shù)以及染色體數(shù)和染色體構(gòu)成進(jìn)行選擇，選出多年生的異源非整倍體飼草品種。本發(fā)明方法將異源非整倍體作為飼草品種應(yīng)用，創(chuàng)造性地拓寬了玉米近緣屬種的應(yīng)用范圍，為玉米近緣屬種材料利用開辟了一個新的途徑；其次，利用本發(fā)明方法育成的材料作為橋梁材料具有極大的利用價值；此外，本發(fā)明可通過無性繁殖方式固定雜種優(yōu)勢，且多年生，生產(chǎn)成本很低，但是產(chǎn)量和營養(yǎng)價值高，經(jīng)濟(jì)效益大。
【專利說明】利用玉米異源多倍體培育非整倍體多年生飼草品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于玉米遠(yuǎn)緣雜交育種領(lǐng)域，具體涉及利用玉米異源多倍體培育非整倍體多年生飼草品種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大芻草與栽培玉米是同一屬中不同亞屬或同一種中的不同亞種。在玉蜀黍?qū)?(Gemus Zea)中，除了栽培玉米亞種(ssp.mays)外的其余7個種或亞種統(tǒng)稱為“大會草” (Teosintes)0在玉米近緣植物中，大芻草與玉米的親緣關(guān)系最近，與玉米雜交能夠獲得有育性的后代。不同類型的大芻草生活在不同的生態(tài)環(huán)境中，具有獨特的特性，是擴(kuò)寬玉米種質(zhì)資源最直接的外緣基因庫。大芻草中，四倍體多年生大芻草(亦稱四倍體多年生類玉米)(Zea Perennis, 2n=40)、二倍體多年生大會草(Zea diploperennis, 2n=20)、繁茂玉米 (Zealuxurians, 2n=20)等近緣種具有多年生、分蘗力強(qiáng)、營養(yǎng)體繁茂等特點，是培育禾本科飼草的種質(zhì)資源。
[0003]四倍體多年生大會草(Zea Perennis)是大會草中唯--個染色體數(shù)為40
(2n=40)的多年生大芻草，可忍耐重霜凍，在寒冷、潮濕等不利條件下生存多年，具有發(fā)達(dá)的根狀莖，形似竹鞭的根狀莖始終保持著分生能力，地上部已開花結(jié)實，甚至完成一個生命周期，地下根莖仍不斷生成分蘗，單株分蘗數(shù)十個，多者可達(dá)數(shù)百個(李冬郁等。玉米科學(xué).2001.9(2):11-13)，具有作為多年生飼草的潛質(zhì)。但是，由于四倍體多年生大芻草莖桿易倒伏，根狀莖具有擴(kuò)張性、侵略性，且種子成熟后自然脫落、四周擴(kuò)散，易造成生物入侵，限制其直接作為多年生飼草的利用。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)利用四倍體多年生大芻草染色體的玉米代換系(2n=20)與四倍體多年生大芻草(2n=40)雜交選育出了具有產(chǎn)量及營養(yǎng)價值高、分蘗力強(qiáng)、多年生、再生性和適應(yīng)性強(qiáng)等特點的飼草玉米(2n=30)(任勇等.作物學(xué)報? 2007 (08): 1360-1365 ;陳柔 ill乞等? Agricultural Science & Technology.2008
(5):74-77)。
[0004]指狀摩擦禾(又稱鴨茅狀摩擦禾，TripsacumdactyloidesL.,2n=72)屬于摩擦禾屬(TripsacumL.),是一種暖季多年生的叢生牧草。由于其根系發(fā)達(dá)、生長繁茂、多年生、生育周期長、持綠期長、適口性良好，在美洲常作為一種優(yōu)質(zhì)牧草(Eubanks等.Maize Genetics Cooperation Newsletter.1993.67:41)。此外，由于再生能力強(qiáng)、適應(yīng)性廣，能在酸性、鹽堿性及潮濕的土壤及環(huán)境條件下生長，摩擦禾又可作為一種優(yōu)良的土壤改良及水土保持 植物(Jack R 等? Proceedings of the National Academy of Sciences.1977.74
(8):3494-3497)。然而，由于其天然種質(zhì)稀少、結(jié)實率低、易脫粒、質(zhì)量差、種子休眠性等問題使種苗生產(chǎn)不足，極大地影響了摩擦禾的推廣利用。指狀摩擦禾具有無融合生殖特性。二倍體摩擦禾為有性生殖，多倍體為兼性無融合生殖，主要是二倍體孢子生殖的形式，即胚珠內(nèi)的孢原或大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂受阻后經(jīng)正常有絲分裂形成未減數(shù)胚囊，而后直接發(fā)育形成胚，再經(jīng)假受精形成胚乳，最終發(fā)育成種子(Kindiger等.Crop science.1996.36(2):250-255)。這種兼性無融合生殖的特性除產(chǎn)生母性后代外，還有少數(shù)的(1-6%)有性雜交后代,且部分有性后代仍可進(jìn)行無融合生殖(Grimanelli等.Apomixis Newsl.1995.8:35-37)，這就為摩擦禾牧草品種改良以及將其優(yōu)良特性轉(zhuǎn)移入栽培玉米的實現(xiàn)提供了可能(Petrov.Proc.Acad.Sc1., Russia.1957.112 (5):954-957)。
[0005]在玉蜀黍族(ZeaL.)中，摩擦禾屬與玉蜀黍?qū)俚挠H緣關(guān)系最近。玉米(n=10)與摩擦禾染色體基數(shù)(n=18)不同,雜交不親合,雜交極難成功。Manglsdorf等將玉米與摩擦禾的混合花粉授于剪短花絲的玉米雌穗上，通過胚拯救技術(shù)，首次成功獲得玉米與摩擦禾的雜種 F1 (Mangelsdorf 等? Journal of Heredity.1931.22 (11): 329-343)。玉米-摩擦禾雜種 F1 代抗玉米根螟蟲(Branson.J.Econ.Entomol.1972.65:195-196),對 NaCl 脅迫的抗性及抗寒性表現(xiàn)出超親優(yōu)勢(Garcia 等? Maize Genetics Cooperation Newsletter.2000 (74):41-42 ；Pesqueira 等.Spanish Journal of Agricultural Research.2003.1
(2): 59-63 ;Jatimliansky 等? Biologia Plantarum.2004.48 (4): 561-567),雜種后代桿粒含有很高的賴氨酸、蛋氨酸和多聚不飽和脂肪酸，其植株莖葉組織中蛋白質(zhì)含量高，且動物的纖維消化率也較高，因此以它們用做食用和飼用作物品種選育的種質(zhì)材料無疑具有很大的優(yōu)勢(Sokolov, et al.，2005)。但無論是玉米與摩擦禾的雜種F1、還是雜種F1隨后的回交、自交等各類型材料都是一年生或弱多年生，制約了摩擦禾在多年生飼草中的直接利用。
[0006]有關(guān)玉米、大芻草和摩擦禾三物種的三元雜交文獻(xiàn)報道較少。Garcia等用四倍體玉米(2n=40)和指狀摩擦禾(Tripsacum dactyloides, 2n=72)雜交獲得雜種 F1 (2n=56), 然后分別用玉米、二倍體多年生大芻草(Zea diploperennis, 2n=20)、四倍體多年生大芻草 (Zea Perennis, 2n=40)花粉與其雜交，經(jīng)檢測，雜交獲得的后代是由無融合生殖特性而獲得的自身雜種，植株染色體數(shù)仍為56條，玉米、大芻草和摩擦禾三物種的遠(yuǎn)緣雜交未獲成功(Garcia, et al.，2000)。Eubanks (1993)報道,用二倍體多年生大會草與摩擦禾雜交可獲得雜種F1，獲得的雜種F1染色體數(shù)2n=20，植株可育，再用玉米花粉與雜種F1雜交，獲得了摩擦禾、二倍體多年生大芻草和玉米的三物種雜交材料，通過該材料選育出了具有摩擦禾優(yōu)良性狀的玉米自交系(Eubanks，1995，1998)，并申請了多項專利進(jìn)行其雜交方法與材料的保護(hù)。但是，該研究成果一經(jīng)報道，立即引起9位世界著名玉米遺傳與進(jìn)化研究學(xué)者質(zhì)疑(Bennetzen 等? Latin American Antiquity.2001:84-86)。
[0007]2006年，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)從北京市農(nóng)林科學(xué)院趙茂林研究員處引進(jìn)源于美國的 Dr.kingder的四倍體玉米(玉米加倍)與指狀摩擦禾(冰淇淋草)的雜種F1 (2n=56)植株， 2006年秋天用四倍體多年生類玉米種與之雜交獲得三元雜種，得到的三元雜種中一株具有生長旺盛、分蘗能力強(qiáng)、多年生的三元雜種，命名為MTF-1。MTF-1的染色體數(shù)目為76，是一個含有玉米、四倍體多年生玉米和摩擦禾全套基因組的異源六倍體；MTF-1不僅克服了摩擦禾結(jié)實率、種子發(fā)芽率低和四倍體多年生玉米莖桿纖細(xì)易倒伏的缺點，同時還保留了多年生、分蘗多、營養(yǎng)生長期長等野生特性，植株生長勢及生物產(chǎn)量上表現(xiàn)了強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢 (蘇月貴.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009.)。但該三元種再生能力相對較弱，在越冬時當(dāng)氣溫低于-4°C時易死亡，影響第二年的再生性，不利于用其直接用作多年生飼草飼用。因此， 必須經(jīng)遺傳改良提高抗冷害能力和再生能力才能在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
[0008]從上述可以看出，無論是玉米、四倍體多年生大芻草還是指狀摩擦禾，作為優(yōu)良飼草利用均有各自的缺點，如玉米為一年生；四倍體多年生大芻草易倒伏，根狀莖具有侵略性，種子易脫落；指狀摩擦禾結(jié)實率低、休眠、種子發(fā)芽率低、草品質(zhì)適口性差；嚴(yán)重制約了玉米、大芻草和摩擦禾直接作為飼草推廣使用。如果以三元種MTF-1為橋梁材料，再利用現(xiàn)實中的能聚合玉米、摩擦禾、四倍體多年生類玉米優(yōu)良特性于一體的多年生飼草選育途徑， 需要找到解決制約大芻草和摩擦禾用于多年生飼草選育中的瓶頸問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的在于提供利用玉米異源多倍體培育非整倍體多年生飼草品種的方法。
[0010]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案: [0011]本發(fā)明利用玉米異源多倍體培育非整倍體多年生飼草品種的方法，包括如下步驟:
[0012](I)、在初春，當(dāng)?shù)販厣?10°C 以上時，對 MTF-1 (Tripsazea creammaizeT.2n=76 ； 蘇月貴，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)進(jìn)行分蔸、扦插或其他無性繁殖方式獲得種苗，按株行距為2mX2m進(jìn)行單株種植；同時，按照株行距為2mX2m種植大芻草；
[0013](2)、在吐絲散粉期，以MTF-1為母本、以大芻草為父本進(jìn)行雜交，成熟時收獲雜交種子；其中所述雜交的授粉方式是人工套袋授粉或者開放授粉；
[0014](3)、將步驟(2)所得的雜交種子種植在人工氣候室的營養(yǎng)缽中，在溫度為28°C、 濕度為70%的條件下進(jìn)行催芽，待幼苗生長至3葉I心時，按照株行距為2mX2m在大田進(jìn)行單株種植；選擇莖桿直立、分蘗數(shù)為10~200個、每莖葉片數(shù)為20~35片、無病害、抗寒能力強(qiáng)，且能安全越冬(最低溫-4°C)具有多年生特性的植株；
[0015](4)、對步驟(3)所選的能安全越冬的植株的根尖進(jìn)行染色體數(shù)鑒定，每株鑒定30~50個細(xì)胞，當(dāng)所觀察的80%以上的細(xì)胞為同一染色體數(shù)時，即確定為該植株的染色體數(shù)，選擇細(xì)胞染色體數(shù)為53~95條的植株；然后采用基因組原位雜交(GISH)和熒光原位雜交(FISH) (Han F 等,Genome2003 (46): 490-495; J.C.Lamb 等，Genetics, 2006 (173): 1007-1021.)對所選植株的染色體構(gòu)成進(jìn)行鑒定，選擇摩擦禾染色體數(shù)目13~35條的非整倍體植株；
[0016](5)、對步驟(4)所選的植株采用分蔸繁殖、扦插繁殖或其他無性繁殖方式獲得種苗，以四倍體多年生類玉米(Zea perennis, 2n=40)為對照連續(xù)進(jìn)行兩年品比實驗；其中第 2年品比試驗所用的材料是在第I年刈割收獲后當(dāng)年再生，第2年在再生的基礎(chǔ)上繼續(xù)分蘗生長而來的；選擇為株高> 250cm、分蘗數(shù)> 10個、葉片數(shù)> 20、越冬率> 90%、蛋白質(zhì)含量≥8.5%、中性洗滌纖維≤60%、酸性洗滌纖維≤40%且鮮草產(chǎn)量高于對照15%以上的品系， 即為新育成的異源非整倍體多年生飼草品種。
[0017]上述方法步驟(1)中所述的玉米異源六倍體MTF-1 (蘇月貴，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)以引自美國的四倍體玉米(Zea mays L.4n=40)和四倍體鴨茅狀摩擦禾(或稱指狀摩擦禾，TripsacumdactyloidesL., 2n=72)之間的屬間雜種F1為母本，以四倍體多年生類玉米(Zea perennis, 2n=40)為父本雜交育成的玉米異源六倍體；MTF_1的染色體數(shù)為76，是一個包含全套玉米染色體組(20條)、鴨茅狀摩擦禾染色體組(36條)和四倍體多年生類玉米染色體組(20條)的屬間雜種，是一個自然界不存在的新物種，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)將新育成的玉米異源六倍體MTF-1分類命名為玉黍禾屬玉淇淋草種，將其拉丁文分類名稱命名為TripsazeacreammaizeT.其中T為MTF-1的育種人及分類人唐祈林的簡稱。[0018]玉米異源六倍體MTF-1 (TripsazeacreammaizeT.)為多年生,無性繁殖,植株范壯,直立叢生,根系發(fā)達(dá)；抽雄時期平均株高為310cm，抽雄期后株高最高可達(dá)335cm，主莖粗9.8-12.9mm，抽雄期單株分蘗達(dá)50-60個，分蘗與主莖莖粗差異不明顯，且整個生命周期中不斷生成新的根分蘗；葉片深綠細(xì)長，葉長61-81cm，葉寬5.1-5.9cm,單個莖桿葉片數(shù)為 20-23片；主莖頂端雄花屬圓錐花序，花序長27-30cm，花粉高度不育，莖桿節(jié)點上著生5_7 個分枝，分枝頂端為穗狀花序的雌花，9-18個小穗在穗軸上呈雙行或四行對生排列。植株雄穗、葉鞘和苞葉均為深紫色。MTF-1雜交可獲得少量種子，種子穎殼堅硬，呈褐色或灰褐色。 植株抗寒抗?jié)衬芰?qiáng)，在0-5及長期水淹條件下仍能持續(xù)長出新分蘗。
[0019]MTF-1主要通過分兜繁殖、莖桿扦插或其他無性繁殖方式等無性繁殖方法進(jìn)行繁殖。公眾可從四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得MTF-1 (TripsazeacreammaizeT.2n=76)生物材料。
[0020]上述方法步驟(1)中所述的大會草是指四倍體多年生類玉米(Zea perennis, 2n=40)、繁茂玉米種(Zea luxurians, 2n=20)、二倍體多年生類玉米(Zea diploperennis, 2n=20)、尼加拉瓜玉米種(2n=20);墨西哥玉米亞種(ssp.mexicana, 2n=20)、小穎玉米亞種 (ssp.parviglumis, 2n=20)和韋韋特南戈亞種(ssp.huehuetenangensis, 2n=20)中之一種。 上述這些大芻草均可從墨西哥小麥玉米改良中心免費獲得。
[0021]所述的四倍體多年生類玉米可以是四倍體多年生類玉米9475 (Zea perennis9475),簡稱9475,可從墨西哥小麥玉米改良中心免費獲得。
[0022]上述方法步驟(2)中所述的雜交，當(dāng)授粉方式采用套袋授粉時，在吐絲前在MTF-1 雌穗上套牛皮紙袋，在吐絲后剪短花絲至l_3cm ;用大芻草花粉給MTF-1雌穗授粉；第1次授粉后第2天重復(fù)授粉I次，再套上牛皮紙袋。
[0023]上述方法步驟(2)中所述的雜交，當(dāng)授粉方式采用開放授粉方式時，需要在MTF-1 種苗周圍2.0~4.0米范圍內(nèi)種植大芻草，吐絲散粉期任大芻草的花粉對MTF-1雌穗進(jìn)行開放授粉。
[0024]上述方法步驟(1)或(5)中所述的扦插繁殖是指以植株莖桿作為扦插枝條進(jìn)行無性繁殖的方法。
[0025]上述方法步驟(1)或(5)中所述的分蔸繁殖是指以植株基部的分蘗為種苗進(jìn)行無性繁殖的方法。
`[0026]上述方法步驟(1)或(5)中所述的其他無性繁殖方式是指以植株莖、葉、胚等具有細(xì)胞全能性的組織進(jìn)行組織培養(yǎng)繁殖的方法。
[0027]上述方法步驟(5)中所述的品比試驗的試驗設(shè)計為3個重復(fù)，每個小區(qū)10m2，按株行距為ImX Im的距離進(jìn)行雙株種植。
[0028]本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果:(I)、本發(fā)明方法克服了玉米及其近緣屬間遠(yuǎn)緣雜交的困難，為在生產(chǎn)中利用玉米近緣屬種提供了一種新的途徑，培育了自然界不存在的新物種。(2)、本發(fā)明為具有生殖障礙的多倍體的育種提供了一種新的育種模式，即利用無融合生殖特性創(chuàng)建異源多倍體，以其作為橋梁材料，再進(jìn)行多倍體的育種或改良。(3)、本發(fā)明方法創(chuàng)建了利用異源非整倍體的多年生飼草品種模式，開拓性地擴(kuò)大了玉米近緣野生種的應(yīng)用范圍。(4)、本發(fā)明方法培育的異源非整倍體飼草新品系，通過無性繁殖方式固定雜種優(yōu)勢，因此不必年年制種，節(jié)約生產(chǎn)成本，此外，還不存在品種退化的問題。(5)本發(fā)明方法綜合利用了玉米的抗倒伏性，摩擦禾的無融合生殖特性、抗逆性，以及四倍體多年生類玉米的無性繁殖特性、多分蘗性、優(yōu)質(zhì)性，在世界上首次培育成了多年生、產(chǎn)量高、抗逆性好、 越冬性強(qiáng)的飼草品種。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1、玉米異源六倍體MTF-1照片。
[0030]圖2、異源非整倍體飼草品系玉淇淋1-7田間照片。
[0031]圖3、異源非整倍體飼草品系玉淇淋1-7染色體GISH+FISH結(jié)果顯微照片，其中箭頭所指為摩擦禾染色體。
[0032]圖4、異源非整倍體飼草品系玉淇淋2-11植株田間照片。
[0033]圖5、異源非整倍體飼草品系玉淇淋2-11染色體GISH+FISH結(jié)果顯微照片，其中箭頭所指為摩擦禾染色體。
[0034]圖6、異源非整倍體飼草品系玉淇淋2-16植株田間照片。
[0035]圖7、異源非整倍體飼草品系玉淇淋2-16染色體GISH+FISH結(jié)果顯微照片，其中箭頭所指為摩擦禾染色體。
[0036]圖8、異源非整倍體飼草品系玉淇淋58植株田間照片。
[0037]圖9、異源非整倍體飼草品系玉淇淋58染色體GISH+FISH結(jié)果顯微照片，其中箭頭所指為摩擦禾染色體。
[0038]圖10、異源非整倍體飼草品系玉淇淋58分蔸繁殖種苗照片。
【具體實施方式】
[0039]實施例1:利用玉米異源多倍體培育非整倍體多年生飼草品種
[0040]按照如下步驟進(jìn)行:`[0041](1)、2007年春季，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)多營農(nóng)場，在地溫升至10°C以上時， 將MTF_l(TripsazeacreammaizeT.2n=76 ;蘇月貴，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009。公眾可從四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)(見圖1)進(jìn)行分蔸繁殖，并將獲得的種苗種至田間，同時，在MTF-1 四周2-4米范圍內(nèi)種植四倍體多年生類玉米9475(Zea perennis9475，2n=40，簡稱為9475， 公眾可從墨西哥小麥玉米改良中心免費獲得)，
[0042](2)、在吐絲散粉期，任四倍體多年生類玉米花粉對MTF-1雌穗(不套袋)進(jìn)行開放授粉，成熟后收獲得雜交代果穗，脫粒保存于-20°C的冰箱。
[0043](3)、2008年春天，于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)抽取100粒雜交后代種子，在人工氣候室的營養(yǎng)缽中，在溫度為28°C、濕度為70%的條件下進(jìn)行催芽，當(dāng)幼苗長至3葉I心時，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)多營農(nóng)場按株行距為2m X 2m進(jìn)行單株種植；2009-2011年，在發(fā)芽的98個個體中，有62個個體能連續(xù)在雅安四川農(nóng)業(yè)大學(xué)多營農(nóng)場、成都市溫江區(qū)公平鎮(zhèn)等試驗地多年生生長，選擇其中表現(xiàn)為莖桿直立、分蘗數(shù)10-200、葉片數(shù)25-35、無病害、抗寒能力強(qiáng)， 且能安全越冬(最低溫_4°C )具有多年生特性的植株共45個。
[0044]表1、本試驗所選飼草品系染色體數(shù)目及染色體組成鑒定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.利用玉米異源多倍體培育非整倍體多年生飼草品種的方法，其特征在于包括如下步驟:(1)、在初春，當(dāng)?shù)販厣?0°C 以上時，對 MTF-1 (Tripsazea creammaizeT.2n=76 ;蘇月貴，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009)進(jìn)行分蔸、扦插或其他無性繁殖方式獲得種苗，按株行距為2mX2m進(jìn)行單株種植；同時，按照株行距為2mX2m種植大芻草；(2)、在吐絲散粉期，以MTF-1為母本、以大芻草為父本進(jìn)行雜交，成熟時收獲雜交種子；其中所述雜交的授粉方式是人工套袋授粉或者開放授粉；(3)、將步驟(2)所得的雜交種子種植在人工氣候室的營養(yǎng)缽中，在溫度為28°C、濕度為70%的條件下進(jìn)行催芽，待幼苗生長至3葉I心時，按照株行距為2mX2m在大田進(jìn)行單株種植；選擇莖桿直立、分蘗數(shù)為10~200個、每莖葉片數(shù)為20~35片、無病害、抗寒能力強(qiáng)，且能安全越冬(最低溫-4°C)具有多年生特性的植株；(4)、對步驟(3)所選的能安全越冬的植株的根尖進(jìn)行染色體數(shù)鑒定，每株鑒定30~50個細(xì)胞，當(dāng)所觀察的80%以上的細(xì)胞為同一染色體數(shù)時，即確定為該植株的染色體數(shù)，選擇細(xì)胞染色體數(shù)為53~95條的植株；然后采用基因組原位雜交(GISH)和熒光原位雜交(FISH) (Han F 等,Genome2003 (46): 490-495; J.C.Lamb 等，Genetics, 2006 (173): 1007-1021.)對所選植株的染色體構(gòu)成進(jìn)行鑒定，選擇摩擦禾染色體數(shù)目13~35條的非整倍體植株；(5)、對步驟(4)所選的植株采用分蔸繁殖、扦插繁殖或其他無性繁殖方式獲得種苗，以四倍體多年生類玉米(Zea perennis, 2n=40)為對照連續(xù)進(jìn)行兩年品比實驗；其中第2年品比試驗所用的材料是在第I年刈割收獲后當(dāng)年再生，第2年在再生的基礎(chǔ)上繼續(xù)分蘗生長而來的；選擇為株高> 250cm、分蘗數(shù)> 10個、葉片數(shù)> 20、越冬率> 90%、蛋白質(zhì)含量≤8.5%、中性洗滌纖維≤60%、酸性洗滌纖維≤40%且鮮草產(chǎn)量高于對照15%以上的品系， 即為新育成的異源非整倍體多年生飼草品種。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟(1)中所述的大芻草是指四倍體多年生類玉米(Zeaperennis, 2n=40)、繁茂玉米種(Zealuxurians, 2n=20)、二倍體多年生類玉米(Zea diploperennis, 2n=20)、尼加拉瓜玉米種(2n=20);墨西哥玉米亞種(ssp.mexicana, 2n=20)、小穎玉米亞種(ssp.parviglumis, 2n=20)和韋韋特南戈亞種(ssp.huehuetenangensis, 2n=20)中之一種。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的四倍體多年生類玉米是四倍體多年生類玉米 9475 (Zea perennis9475)。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟(2)中所述的雜交，當(dāng)授粉方式采用套袋授粉時，在吐絲前在MTF-1雌穗上套牛皮紙袋，在吐絲后剪短花絲至l-3cm ;用大芻草花粉給MTF-1雌穗授粉；第1次授粉后第2天重復(fù)授粉I次，再套上牛皮紙袋。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟(2)中所述的雜交，當(dāng)授粉方式采用開放授粉方式時，需要在MTF-1種苗周圍2.0~4.0米范圍內(nèi)種植大芻草，吐絲散粉期任大芻草的花粉對MTF-1雌穗進(jìn)行開放授粉。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟(1)或(5)中所述的扦插繁殖是指以植株莖桿作為扦插枝條進(jìn)行無性繁殖的方法。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟(1)或(5)中所述的分蔸繁殖是指以植株基部的分蘗為種苗進(jìn)行無性繁殖的方法。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟(1)或(5)中所述的其他無性繁殖方式是指以植株莖、葉、胚等具有細(xì)胞全能性的組織進(jìn)行組織培養(yǎng)繁殖的方法。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟(5)中所述的品比試驗的試驗設(shè)計為3個重復(fù)，每個小區(qū)10m2，按株行距為ImX Im的距離進(jìn)行雙株種植`。
【文檔編號】A01H1/04GK103548674SQ201310566537
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】唐祈林, 榮廷昭, 李華雄, 鄭名敏, 程明軍, 蘇月貴, 周樹峰, 吳元奇, 曹墨菊, 蔣偉 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)