一種獲得紫色葉背草莓植株的方法
【專利摘要】一種獲得紫色葉背草莓的方法，其是攜帶已構(gòu)建完成的植物表達載體pCAMBIA2301-del-ros的根癌農(nóng)桿菌，在含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時后備用；將草莓哈尼組培苗在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)30-40天，取伸展葉片剪成葉盤，放在備用培養(yǎng)物中3-7分鐘，后接種在再生培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1-2天；將葉盤轉(zhuǎn)接在含頭孢霉素300-400mg/L、卡那霉素5mg/L的分化培養(yǎng)基上，在（25±1）℃、光周期16小時光照/8小時黑暗、光照強度30μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)30-40天，將獲得的不定芽切下，接種在生根培養(yǎng)基上，置光周期16小時光照/8小時黑暗、光照強度30μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)30-40天完成生根；進一步鑒定后獲得紫色葉背的草莓植株。
【專利說明】一種獲得紫色葉背草莓植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生紫色葉背草莓的方法，特別地，是一種通過基因調(diào)控手段產(chǎn)生紫色葉背草莓植株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]草莓(Fragaria ananassa Duch)是薔薇科草莓屬多年生草本植物,是一種世界各國廣泛栽培的水果，素有水果皇后之稱。由于其高雜合性和多倍性，使得雜交育種工作周期長、工作量大。利用基因調(diào)控技術(shù)培育草莓品種可以定向改良現(xiàn)有品種，大大提高育種效率。將成為草莓品種改良的一種重要手段，目前應(yīng)用于草莓上的基因?qū)敕ㄖ饕寝r(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法?；ㄇ嗨乜梢詫θ梭w的許多疾病如癌癥、心血管疾病和神經(jīng)性疾病等起防御作用，草莓本身具有完整的花青素合成路徑。利用該項技術(shù)和方法就可以獲得含更多花青素的果實。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種植物表達載體pCAMBIA2301-del_ros及其構(gòu)建方法。
[0004]本發(fā)明的另一個目的是提供一種產(chǎn)生紫色葉背草莓的方法，特別地，是一種通過基因調(diào)控手段產(chǎn)生紫色葉背草莓植株的方法。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]一種植物表達載體pCAMBIA2301-del_ros,其序列如序列表SEQ ID:N0.1所示。
[0007]如上所述的植物表達載體pCAMBIA2301-del_ros，其圖譜如圖1所示。
`[0008]一種如上所述植物表達載體pCAMBIA2301-del-ros的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0009]第一步，pBI121-del-Tnos表達載體構(gòu)建
[0010]在花青素調(diào)控基因del兩端引入BamHI和SacI酶切位點，將質(zhì)粒pBI121-35s-Tn0s用BamHI和SacI兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段，將del基因的片段，插入pBI121-35s-Tnos的BamHI和SacI位點間，35s啟動的del基因表達載體pBI121-35s-del_Tnos 構(gòu)建完成；
[0011]第二步，pCAMBIA1301-35s-ros-Tnos表達載體的構(gòu)建
[0012]在花青素調(diào)控基因ros兩端引入NcoI和BstEII酶切位點，將質(zhì)粒pCAMBIA301-35S-Tnos用NcoI和BstEII兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段pCAMBIA1301-35s-Tnos,將ros基因的片段插入得到用35s驅(qū)動的ros基因表達載體pCAMBIA1301-35s-ros - Tnos ；
[0013]第三步，pCAMBIA2301-del-ros表達載體的構(gòu)建
[0014]將質(zhì)粒pCAMBIA2301-35S-Tnos用HindIII和BstEII兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段 PCAMBIA2301-Tnos，將表達載體 pCAMBIA1301-35s-ros-Tnos 用 HindIII和BstEII兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體片段-35s-r0s-，將載體片段-35S_rOS-插入PCAMBIA2301-Tnos 的 HindIII 和 BstEII 位點之間，得到 pCAMBIA2301-35s-ros_Tnos表達載體，將該表達載體用BamHI和Kpnl兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段 pCAMBIA2301-35s-ros-Tnos，將表達載體 pBI121-35s-del-Tnos 的兩端以 PCR 的方法添加 酶切位點Kpnl和Bglll，酶切后將所得的片段插入由Kpnl和BamHI兩個內(nèi)切酶酶切后回 收的載體大片段pCAMBIA2301-35s-ros-Tnos上，得到以Kan基因為篩選標記35S分別啟動 的del、ros基因表達載體pCAMBIA2301-35s-del-Tnos-35s-ros_Tnos,即得植物表達載體 pCAMBIA2301-del-ros。
[0015]一種獲得紫色葉背草莓的方法，該方法的步驟如下：
[0016]A.構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2301-del-ros，將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，隨后 在28°C下在含lOOmg ? L—1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時；
[0017]B.將草莓哈尼的組織培養(yǎng)苗在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)30-40天，之后在無菌條件下取 組織培養(yǎng)伸展葉片，剪成面積約0. lcm2的葉盤，放在步驟A得到的培養(yǎng)物中3-7分鐘，然后 接種在再生培養(yǎng)基上，黑暗條件培養(yǎng)下1-2天；
[0018]C.將經(jīng)過步驟B培養(yǎng)的草莓葉盤轉(zhuǎn)接在含300-400mg七1頭孢霉素和5mg噸―1卡 那霉素的分化培養(yǎng)基上，在溫度（25±1) °C、光周期為16小時光照/8小時黑暗、光照強度 為30 y mol ? m_2 ? s—1的條件下再培養(yǎng)30-40天，獲得轉(zhuǎn)化芽；
[0019]D.將步驟C中獲得的轉(zhuǎn)化芽切下，接種在生根培養(yǎng)基上，置于光周期為16小時光 照/8小時黑暗、光照強度為30 u mol ? m_2 ? s—1的條件下培養(yǎng)30-40天，即可完成生根；
[0020]E.取步驟D中得到的植株進行草莓葉片的外觀鑒定，從而獲得紫色葉背的草莓。
[0021]如上所述的方法，優(yōu)選地，所述步驟B中，草莓哈尼的組織培養(yǎng)苗按照以下步驟得 到：秋季采草莓哈尼匍匐莖上飽滿的芽，流水沖洗3小時，用0. 1%的HgC12水溶液處理6分 鐘，無菌水沖洗6次，用無菌吸水紙吸干殘留水分，將芽接種到初代培養(yǎng)基上；在接種后的 第二天開始有部分材料開始褐化，一旦發(fā)現(xiàn)有褐化的材料，馬上更換為新的初代培養(yǎng)基，直 到褐化消除；接種10天時，飽滿的芽都開始萌發(fā)，30天時長成約3cm左右的組培苗。
[0022]如上所述的方法，優(yōu)選地，所述初代培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30g ? I71蔗 糖、6. 5g ? I71 瓊脂粉、1. Omg ? L_16-節(jié)基腺嘌呤（6-benzyladenine)和 0. 2mg ? I71 卩引哚丁酸 (indole-3-butyric acid), pH5. 6 的培養(yǎng)基。
[0023]如上所述的方法，優(yōu)選地，所述步驟B中，繼代培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加 30g ? L—1蔗糖、6. 5g ? L—1瓊脂粉、0. 2-0. 3mg ? L^6-芐基腺嘌呤和0. lmg ? L—1吲哚丁酸， pH5. 6的培養(yǎng)基。
[0024]如上所述的方法，優(yōu)選地，所述步驟B中，再生培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加 30g ? L-1 蔗糖、6. 5g ? L-1 瓊脂粉、2. 0-4. Omg ? L^N-苯基-N’ -1，2，3-噻二唑-5-脲，pH5. 6
的培養(yǎng)基。
[0025]如上所述的方法，優(yōu)選地，所述步驟C中，分化培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中 附加30g ? I/1鹿糖、6. 5g ? I71瓊脂粉、300-400mg ? I71頭孢霉素、5mg ? I71卡那霉素、 2. 0-4. Omg d 苯基-N，-1，2，3-噻二唑 ~5~ 脲和 0. 2mg .I71 吲哚丁酸，pH5. 6 的培養(yǎng)基。
[0026]如上所述的方法，優(yōu)選地，所述步驟D中，生根培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加 30g ? L—1蔗糖、6. 5g ? L—1瓊脂粉和0. 2mg ? L—1吲哚丁酸，pH5. 6的培養(yǎng)基。
[0027]如上所述的方法，優(yōu)選地，所述步驟4中，載體口041?從2301-(^1-1'08轉(zhuǎn)化LBA4404 的操作步驟如下：[0028](I)分別取 10 μ L 濃度為 0.1-0.5ng/ μ L 的載體 pCAMBIA2301-del_ros 和100 μ LOD600為0.5-1.0的根癌農(nóng)桿菌LBA4404加在1.5ml的離心管中，混勻，冰上放置30分鐘；
[0029](2)液氮中速凍2-3分鐘，37°C水浴3分鐘；
[0030](3)再加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基，在28°C條件下，180轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-4小時，該LB液體培養(yǎng)基為IOg.L-1蛋白胨、5g.L-1酵母提取物、IOg.T1NaCl, pH7.0的培養(yǎng)基；
[0031](4)然后5000rpm離心5分鐘，離心管底部留100 μ L，混勻涂板，培養(yǎng)皿中LB固體培養(yǎng)基含IOOmg.L-1卡那霉素，并含有IOg.Ι71蛋白胨、5g.L-1酵母提取物、IOg.L-1NaCl和 6.5g.L-1 瓊脂粉，pH7.0 ；
[0032](5)挑出長出的單菌落，經(jīng)PCR鑒定為陽性的根癌農(nóng)桿菌LBA4404即為轉(zhuǎn)化植物材料。
[0033]本發(fā)明的有益效果在于:本申請采用轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控手段，以35S啟動子驅(qū)動將調(diào)控花青素合成的兩個轉(zhuǎn)錄因子del和ros —起導(dǎo)入草莓中，通過添加酶切位點或使用同尾酶的手段克服了載體上酶切位點不夠使或不能用的問題，從而獲得紫色葉背的草莓植株。它對于人工創(chuàng)新草莓新材料是一個有益的嘗試。在本發(fā)明的實驗過程中，同一批次實驗采用6個培養(yǎng)皿，每個皿放置26-30個葉盤，實驗重復(fù)5次，共計葉盤總量為804個，獲得紫紅葉背草莓植株17份，效率超過2%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1為pCAMBIA2301-del_ros植物表達載體的圖譜。
[0035]圖2為構(gòu)建pCAMBIA2301-del-ros植物表達載體的第一步的流程圖。
[0036]圖3為構(gòu)建pCAMBIA2301-del-ros植物表達載體的第二步的流程圖。
[0037]圖4為構(gòu)建pCAMBIA2301-del-ros植物表達載體的第三步的流程圖。
[0038]圖5為準備處理的草莓葉盤照片。
[0039]圖6為采用本發(fā)明方法獲得的紫色葉片草莓植株。
[0040]圖7為紫色葉背照片。
[0041]圖8紫色葉片正面照片。
【具體實施方式】
[0042]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0043]實施例1構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2301-del_ros
[0044]蛋白胨和酵母提取物商品購得，草莓匍匐莖在我單位草莓國家資源圃采樣取得。PBI121和pCAMBIA2301為商品載體，花青素調(diào)控基因del和ros依據(jù)Genebank公開序列我們從金魚草紫色花中克隆得到。
[0045]構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2301-del-ros，所述載體的圖譜如圖1所示。其序列如序列表SEQ ID:N0.1所示，其中，〈1-663〉為ros基因序列，〈1_22>為ros上游序列，即atggaaaaga attgtcgtgg ag ;〈641_663> 為 ros 下游序列，即 aggcccaaca aattggaaat taa ；〈664-934〉為 nos 終止子，〈9436-9709〉為 nos 終止子，〈9710-11599〉為 del 基因序列，〈9710-9735〉為 del 的下游序列，即 tagtaacttt ctgaagagct tgttt ;〈11579_11599> 為 del上游序列，即 tggaatcc gaggaggttt cccgat ;〈11600_12495> 為 35S 序列，〈12496-13054〉為35S序列。其構(gòu)建步驟為:
[0046]第一步，pBI121-del-Tnos表達載體構(gòu)建
[0047]在花青素調(diào)控基因del兩端引入BamHI和SacI酶切位點，將質(zhì)粒pBI121-35s-Tn0s用BamHI和SacI兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段，將del基因的片段，插入pBI121-35s-Tnos的BamHI和SacI位點間，35s啟動的del基因表達載體pBI121-35s-del-Tnos構(gòu)建完成，具體操作可參見圖2所示的流程圖。
[0048]第二步，pCAMBIA1301-35s-ros-Tnos表達載體的構(gòu)建
[0049]在花青素調(diào)控基因ros兩端引入NcoI和BstEII酶切位點，將質(zhì)粒pCAMBIA301-35S-Tnos用NcoI和BstEII兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段pCAMBIA1301-35s-Tnos,將ros基因的片段插入得到用35s驅(qū)動的ros基因表達載體pCAMBIA1301-35s-ros - Tnos，具體操作可參見圖3所示的流程圖。
[0050]第三步，pCAMBIA2301-del-ros表達載體的構(gòu)建
[0051]將質(zhì)粒pCAMBIA2301-35S-Tnos用HindIII和BstEII兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段 PCAMBIA2301-Tnos，將表達載體 pCAMBIA1301-35s-ros-Tnos 用 HindIII和BstEII兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體片段-35s-r0s-，將載體片段-35S_rOS-插入PCAMBIA2301-Tnos 的 HindIII 和 BstEII 位點之間，得到 pCAMBIA2301-35s-ros_Tnos表達載體，將該表達載體用BamHI和KpnI兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段pCAMBIA2301-35s-ros-Tnos，將表達載體 pBI121-35s-del-Tnos 的兩端以 PCR 的方法添加酶切位點KpnI和Bglll，酶切后將所得的片段插入由KpnI和BamHI兩個內(nèi)切酶酶切后回收的載體大片段pCAMBIA2301-35s-ros-Tnos上，得到以Kan基因為篩選標記35S分別啟動的del、ros基因表達載體pCAMBIA2301-35s-del-Tnos-35s-ros_Tnos,即得到本發(fā)明使用的植物表達載體pCAMBIA2301-del-ros，具體操作可參見圖4所示的流程圖。
[0052]實施例2紫色葉背草莓的獲得
[0053]1.將實施例1得到的載體pCAMBIA2301-del-ros轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404。轉(zhuǎn)化操作步驟如下:
[0054](I)分別取 10 μ L 濃度為 0.4ng/ μ L 的載體 pCAMBIA2301-del_ros 和 100 μ LOD600為0.6的農(nóng)桿菌感受態(tài)LBA4404加在1.5ml的離心管中，混勻，冰上放置30分鐘；
[0055](2 )液氮中速凍2-3分鐘，37 °C水浴3分鐘；
[0056](3)再加入800 μ LLB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，在28°C條件下，180轉(zhuǎn)培養(yǎng)2_4小時，(其中，LB液體培養(yǎng)基為IOg.L-1蛋白胨、5g.l-1酵母提取物、IOg.L^1NaCl, pH7.0的培養(yǎng)基);
[0057](4)然后5000rpm離心5分鐘，離心管底部留100 μ L，混勻涂板(培養(yǎng)皿中LB固體培養(yǎng)基含IOOmg *L_1卡那霉素,所述LB固體培養(yǎng)基為IOg *L_1蛋白胨、5g *L_1酵母提取物、IOg.T1NaCl、6.5g.l-1 瓊脂粉，pH7.0 的培養(yǎng)基)；
[0058](5)挑出長出的單菌落，經(jīng)PCR鑒定為陽性的根癌農(nóng)桿菌LBA4404就可以轉(zhuǎn)化植物材料了。
[0059]2.轉(zhuǎn)化后的根癌農(nóng)桿菌LBA4404，在28°C下在含IOOmg.L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時，備用。[0060]3.按以下步驟操作得到草莓哈尼的組織培養(yǎng)苗(組培苗):秋季采草莓匍匐莖上飽滿的芽，流水沖洗3小時，用0.1%的升汞(HgC12)處理6分鐘，無菌水沖洗6次，用無菌吸水紙吸干殘留水分，將芽接種到初代培養(yǎng)基上。該初代培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30g.I/1蔗糖、6.5g.1瓊脂粉、1.0mg.L^6-芐基腺嘌呤和0.2mg.1吲哚丁酸，pH5.6的培養(yǎng)基。在接種后的第二天開始有部分材料開始褐化，一旦發(fā)現(xiàn)有褐化的材料，馬上更換為新的初代培養(yǎng)基，直到褐化消除；接種10天時，飽滿的芽都開始萌發(fā)，30天時長成約3cm左右的組培苗。以后每月繼代一次。繼代培養(yǎng)基為:在MS基本培養(yǎng)基中附加30g.I/1蔗糖、
6.5g.1瓊脂粉、0.2mg.1^6-芐基腺嘌呤和0.1mg.1吲哚丁酸，pH5.6的培養(yǎng)基。將哈尼組培苗在該繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長35天，即可切取葉盤進行基因?qū)搿?br>
[0061]上述MS基本培養(yǎng)基的配方如下表，其中各組分單位為mg.1:
[0062]表1
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種植物表達載體pCAMBIA2301-del-ros，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID:N0.1所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述植物表達載體pCAMBIA2301-del-rOS的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: 第一步，pBI121-del-Tnos表達載體構(gòu)建 在花青素調(diào)控基因del兩端引入BamHI和SacI酶切位點，將質(zhì)粒pBI121-35s-Tnos用BamHI和SacI兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段，將del基因的片段，插入pBI121-35s-Tnos的BamHI和SacI位點間，35s啟動的del基因表達載體pBI121-35s-del_Tnos 構(gòu)建完成； 第二步，pCAMBIA1301-35s-ros-Tnos表達載體的構(gòu)建 在花青素調(diào)控基因ros兩端引入NcoI和BstEII酶切位點，將質(zhì)粒pCAMBIA301-35S-Tnos用NcoI和BstEII兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段pCAMBIA1301-35s-Tnos,將ros基因的片段插入得到用35s驅(qū)動的ros基因表達載體pCAMBIA1301-35s-ros - Tnos ； 第三步，pCAMBIA2301-del-ros表達載體的構(gòu)建 將質(zhì)粒pCAMBIA2301-35S-Tnos用HindIII和BstEII兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段 pCAMBIA2301-Tnos，將表達載體 pCAMBIA1301-35s-ros_Tnos 用 HindIII 和 BstEII 兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體片段-35s-ros-，將載體片段-35s-ros-插入pCAMBIA2301-Tnos的HindIII和BstEII位點之間，得到pCAMBIA2301-35s-ros-Tnos表達載體，將該表達載體用BamHI和KpnI兩個內(nèi)切酶酶切后回收載體大片段pCAMBIA2301-35s-ros_Tnos，將表達載體pBI121-35S-del-TnOS的兩端以PCR的方法添加酶切位點KpnI和Bglll，酶切后將所得的片段插入由KpnI和BamHI兩個內(nèi)切酶酶切后回收的載體大片段pCAMBIA2301-35s-ros_Tnos上，得到以Kan基因為篩選標記35S分別啟動的del、ros基因表達載體pCAMBIA2301_35s-del-Tnos-35s-ros-Tnos,即得植物表達載體 pCAMBIA2301-del-ros。
3.一種獲得紫色葉背草莓的方法，其特征在于，該方法的步驟如下: A.構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA2301-del-ros，將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，隨后在28°C下在含IOOmg.L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時； B.將草莓哈尼的組織培養(yǎng)苗在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)30-40天，之后在無菌條件下取組織培養(yǎng)伸展葉片，剪成面積約0.1cm2的葉盤，放在步驟A得到的培養(yǎng)物中3-7分鐘，然后接種在再生培養(yǎng)基上，黑暗條件培養(yǎng)下1-2天； C.將經(jīng)過步驟B培養(yǎng)的草莓葉盤轉(zhuǎn)接在含300-400mg.L-1頭孢霉素和5mg.L-1卡那霉素的分化培養(yǎng)基上，在溫度(25±1) °C、光周期為16小時光照/8小時黑暗、光照強度為30 μ mo I.m-2.s_1的條件下再培養(yǎng)30_40天，獲得轉(zhuǎn)化芽； D.將步驟C中獲得的轉(zhuǎn)化芽切下，接種在生根培養(yǎng)基上，置于光周期為16小時光照/8小時黑暗、光照強度為30 μ mol.πM-2.s—1的條件下培養(yǎng)30-40天，即可完成生根； E.取步驟D中得到的植株進行草莓葉片的外觀鑒定，從而獲得紫色葉背的草莓。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟B中，草莓哈尼的組織培養(yǎng)苗按照以下步驟得到:秋季采草莓哈尼匍匐莖上飽滿的芽，流水沖洗3小時，用0.1%的HgC12水溶液處理6分鐘，無菌水沖洗6次，用無菌吸水紙吸干殘留水分，將芽接種到初代培養(yǎng)基上；在接種后的第二天開始有部分材料開始褐化，一旦發(fā)現(xiàn)有褐化的材料，馬上更換為新的初代培養(yǎng)基，直到褐化消除；接種10天時，飽滿的芽都開始萌發(fā)，30天時長成約3cm左右的組培苗。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述初代培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30g *L-1 鹿糖、6.5g *L-1 瓊脂粉、1.0mg·L-16-芐基腺嘌呤(6-benzyladenine)和 0.2mg *L-1口引哚丁酸(indole-3-butyric acid), pH5.6 的培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟B中，繼代培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30g·L-1蔗糖、6.5g·L-1瓊脂粉、0.2-0.3mg.L-1 6-芐基腺嘌呤和0.1mg·L-1吲哚丁酸，PH5.6的培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟B中，再生培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加 30g·L-1 蔗糖、6.5g·L-1瓊脂粉、2.0-4.0mg·L-1N-苯基-N’-1，2，3-噻二唑-5-脲，ΡΗ5.6的培養(yǎng)基。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟C中，分化培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30g.L-1鹿糖、6.5g.L-1瓊脂粉、300-400mg.L-1頭孢霉素、5mg.L-1卡那霉素、2.0-4.0mg.L-1N-苯基-N，-1, 2，3-噻二唑 ~5~ 脲和 0.2mg.171 吲哚丁酸，ρΗ5.6 的培養(yǎng)基。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟D中，生根培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30g·L-1蔗糖、6.5g·L-1瓊脂粉和0.2mg·L-1吲哚丁酸，pH5.6的培養(yǎng)基。
10.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟A中，載體pCAMBIA2301-del-ros轉(zhuǎn)化LBA4404的操作步驟如下:
(1)分別取10 μ L 濃度為 0.1-0.5ng/ μ L 的載體 pCAMBIA2301-del_ros 和 100 μ LOD600為0.5-1.0的根癌農(nóng)桿菌LBA4404加在1.5ml的離心管中，混勻，冰上放置30分鐘； (2)液氮中速凍2-3分鐘，37°C水浴3分鐘； (3)再加入800μ L LB液體培養(yǎng)基，在28°C條件下，180轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-4小時，該LB液體培養(yǎng)基為1Og·L-1蛋白胨、5g·L-1酵母提取物、1Og·L-1NaCl, pH7.0的培養(yǎng)基； (4)然后5000rpm離心5分鐘，離心管底部留100μ L，混勻涂板，培養(yǎng)皿中LB固體培養(yǎng)基含IOOmg.L-1卡那霉素，并含有1Og·L-1蛋白胨、5g.L-1酵母提取物、1Og.L-1NaCl和6.5g.L-1 瓊脂粉，ρΗ7.0 ； (5)挑出長出的單菌落，經(jīng)PCR鑒定為陽性的根癌農(nóng)桿菌LBA4404即為轉(zhuǎn)化植物材料。
【文檔編號】A01H4/00GK103509822SQ201310512144
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】金萬梅, 王 華, 范艷珍, 王文娟 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院