一種用于防治作物鐮刀菌病害的綠針假單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于防治作物鐮刀菌病害的綠針假單胞菌及其應(yīng)用。所述綠針假單胞菌的保藏號為：CGMCC?No.7729。本發(fā)明的綠針假單胞菌Pcho01菌株對鐮刀菌具有高效拮抗作用，能用于由鐮刀菌侵染引起的小麥赤霉病的防治，田間防治的防治效率穩(wěn)定在60%以上；Pcho01菌株對灰霉病菌、紋枯病菌、玉米小斑病菌、終極腐霉、根霉及青枯病菌也有很好的拮抗效果，可用于防治由這些病菌侵染引起的植物病害。
【專利說明】一種用于防治作物鐮刀菌病害的綠針假單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物種質(zhì)資源的開發(fā)與利用領(lǐng)域，具體涉及一種用于防治作物鐮刀菌病害的綠針假單胞菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鐮刀菌(Fusarium)屬半知菌亞門真菌,是一類世界性分布的真菌,它不僅可以在土壤中越冬越夏，還可侵染多種植物(糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、藥用植物及觀賞植物)，引起植物的穗腐、根腐、莖腐、莖基腐、花腐等多種病害，寄主植物達(dá)100余種，侵染寄主植物維管束系統(tǒng)，破壞植物的輸導(dǎo)組織維管束，并在生長發(fā)育代謝過程中產(chǎn)生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影響產(chǎn)量和品質(zhì)。其中以禾谷鐮孢菌、尖孢鐮孢菌引起的病害最為嚴(yán)重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]禾谷鍵抱菌(Fusariumgraminearum Schw.),有性態(tài)為 Gibberella zeae Schw.petch.稱玉蜀黍赤霉。該菌能引起田間小麥、大麥等禾本科作物的病害。由禾谷鐮孢菌引起的小麥赤霉病菌不僅影響小麥產(chǎn)量，而且其產(chǎn)生的真菌毒素污染產(chǎn)品質(zhì)量，嚴(yán)重威脅人畜健康。尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)是一種世界性分布的土傳病原真菌,寄主范圍廣泛，可引起瓜類、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多種植物枯萎病的發(fā)生。鐮刀菌引起的小麥赤霉病、爺科(番爺)、瓜類(西瓜)枯萎病，是生產(chǎn)上防治最艱難的重要病害之一。
[0004]目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治由鐮刀菌引起的小麥赤霉病、番茄枯萎病、西瓜枯萎病主要以多菌靈、戊唑醇等化學(xué)殺菌劑為主。但是，隨著多菌靈等殺菌劑的長期使用已導(dǎo)致使用次數(shù)和用藥濃度增加，也提高了病原菌產(chǎn)生對殺菌劑的抗性的風(fēng)險。同時，由于化學(xué)殺菌劑的廣譜性，大量使用不但破壞了微生態(tài)環(huán)境，而且導(dǎo)致非靶標(biāo)抗性。
[0005]相對于化學(xué)殺菌劑，生物防治劑和天然產(chǎn)物的使用，尤其是微生物殺菌劑的使用具有更加誘人的前景。一方面微生物是地球上最龐大的生物類群，具有廣泛的生物多樣性，還可以通過生物工程技術(shù)大幅度提高目標(biāo)物質(zhì)的產(chǎn)量，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；另一方面，微生物殺菌劑較化學(xué)農(nóng)藥更加安全，易降解，合成成本較低。
[0006]假單胞菌是活躍在植物根際的一類微生物，許多菌株有抑制植物病害、促進(jìn)植株生長的作用，這些具有生防作用的菌株尤以熒光性假單胞菌為主，包括銅綠假單胞菌、致金色假單胞菌、綠針假單胞菌、熒光假單胞菌等。
[0007]雖然很多種假單胞菌都已被開發(fā)用于制備微生物殺菌劑，但由于假單胞菌種群即菌株的多樣性，不同假單胞菌乃至同一假單胞菌的不同菌株均具有不同的抗菌譜、抗菌活性和抗菌特點(diǎn)，篩選具有不同作用對象的高效假單胞菌生防菌劑仍是現(xiàn)在乃至今后相對長一段時間內(nèi)各國科研工作關(guān)注的課題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明提供了一種綠針假單胞菌，該綠針假單胞菌對由鐮刀菌引起的小麥赤霉病的防治效果達(dá)60%以上。[0009]一種綠針假單胞菌，分類命名為綠針假單胞菌(Pseudomonas choloraphis),株號為PchoOl,已于2013年6月18日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為=CGMCCN0.7729。
[0010]本發(fā)明還提供了一種含有所述綠針假單胞菌的生防菌劑。該生防菌劑中，所述綠針假單胞菌的濃度優(yōu)選為I X IO9~101(lCFU/mL，更優(yōu)選為I X 109CFU/mL。
[0011]本發(fā)明還提供了一種所述生防菌劑的制備方法，包括:
[0012](I)將所述綠針假單胞菌接種于培養(yǎng)液中培養(yǎng)至培養(yǎng)液OD6tltl為0.5~0.8，獲得種子液；
[0013]所述培養(yǎng)液可選用LB液體培養(yǎng)基，其配方為:氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.0 ；
[0014](2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),調(diào)節(jié)發(fā)酵液中綠針假單胞菌的濃度至I X IO9~101QCFU/mL，獲得所述生防菌劑。
[0015]其中，所述種子液的接種量優(yōu)選為I~2%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可選用金氏培養(yǎng)液(King’ s Broth)，其配方為:蛋白胨 2g，甘油 10g，K2HPO4L 5 g，MgSO4.7Η201.5g，瓊脂 15g，pH7.2,10OOmT,水。
[0016]本發(fā)明中，所述 擴(kuò)大培養(yǎng)是在200L發(fā)酵罐中進(jìn)行的，擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為28~30°C，時間為36~48h ;發(fā)酵液pH值維持在7.0，溶氧量20%，通氣量5-7m3/小時，轉(zhuǎn)速240~260r/min，罐壓0.05-0.1KPa0發(fā)酵液出罐后梯度稀釋涂板檢測并調(diào)節(jié)菌懸液濃度為IXlO9 ~1010CFU/mL。
[0017]本發(fā)明還提供了所述綠針假單胞菌在拮抗鐮刀菌上的應(yīng)用。在平板拮抗試驗(yàn)中，PchoOl菌株對禾谷鐮孢菌的抑菌圈半徑為10mm，菌絲抑制率為76%，EC50值為7CFU/mL。PchoOl菌株的發(fā)酵液上清不僅能有效抑制菌絲生長，還能強(qiáng)烈抑制禾谷鐮孢菌PH-1孢子的萌發(fā)，處理后的孢子不能形成芽管，萌發(fā)率極低。
[0018]本發(fā)明還提供了所述綠針假單胞菌在防治小麥赤霉病中的應(yīng)用，包括:在小麥齊穗期或揚(yáng)花初期，將綠針假單胞菌菌懸液均勻噴施在小麥穗部；所述綠針假單胞菌菌懸液的濃度為I X IO8~109CFU/mL。
[0019]PchoOl菌株能顯著抑制禾谷鐮孢菌PH-1在揚(yáng)麥18和濟(jì)麥22麥穗上的生長及致病性，防治效果分別可達(dá)98.64%，97.19%。將PchoOl菌株應(yīng)用于田間防治小麥赤霉病時，其防治效果穩(wěn)定在60%左右，顯示出較好的應(yīng)用前景。
[0020]本發(fā)明還提供了所述綠針假單胞菌在拮抗番茄枯萎病菌、灰霉病菌、紋枯病菌、玉米小斑病菌、終極腐霉、根霉或青枯病菌中的應(yīng)用，PchoOl菌株對這些病菌都有很好的拮抗效果，可用于防治由這些病菌侵染引起的植物病害。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0022]本發(fā)明的綠針假單胞菌PchoOl菌株對鐮刀菌具有高效拮抗作用，能用于由鐮刀菌侵染引起的小麥赤霉病的防治，田間防治的防治效率穩(wěn)定在60%以上；Pcho01菌株對灰霉病菌、紋枯病菌、玉米小斑病菌、終極腐霉、根霉及青枯病菌也有很好的拮抗效果，可用于防治由這些病菌侵染引起的植物病害?！緦＠綀D】
【附圖說明】
[0023]圖1為生防菌PchoOl的菌落形態(tài)圖；
[0024]圖2a為生防菌PchoOl對禾谷鐮孢菌PH-1的平板拮抗效果圖；
[0025]圖2b為生防菌PchoOl對灰霉病菌的平板拮抗效果圖；
[0026]圖2c為生防菌PchoOl對小麥紋枯病菌的平板拮抗效果圖；
[0027]圖2d為生防菌PchoOl對玉米小斑病菌的平板拮抗效果圖；
[0028]圖2e為生防菌PchoOl對終極腐霉的平板拮抗效果圖；
[0029]圖2f為生防菌PchoOl對根霉的平板拮抗效果圖；
[0030]圖2g為生防菌PchoOl對水稻紋枯病菌的平板拮抗效果圖；
[0031]圖2h為生防菌PchoOl對青枯病菌的平板拮抗效果圖；
[0032]圖3a為不同含菌量的PchoOl和PY79平板對PH-1菌絲生長抑制圖；其中，箭頭表示W(wǎng)A平板中PchoOl和PY79的含菌量(Log1(lCFU/mL)逐漸變?。弧癙H_1”表示PH-1直接接種在不含生防菌的WA平板上生長的菌落；
[0033]圖3b為生防菌PchoOl對禾谷鐮孢菌PH-1的EC50測定結(jié)果圖；其中，折線為各生防菌濃度下對應(yīng)PH-1菌落直徑的點(diǎn)連線，直線為折線的趨勢線；
[0034]圖4生防菌PchoOl的發(fā)酵液上清抑制禾谷鐮孢菌菌絲生長的活性測試圖；
[0035]圖5為H20、PY79發(fā)酵液上清和PchoOl發(fā)酵液上清處理后禾谷鐮孢菌PH-1孢子的萌發(fā)示意圖；
[0036]圖6a為光照培養(yǎng)箱內(nèi)H20、PY79、Pcho01和氰烯菌酯對濟(jì)麥22的小麥赤霉病防治效果圖；
[0037]圖6b為光照培養(yǎng)箱內(nèi)H20、PY79、Pcho01和氰烯菌酯對揚(yáng)麥18的小麥赤霉病防治效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]實(shí)施例1含PchoOl菌株的生防菌劑的制備
[0039]IPchoOl菌株的獲取
[0040]綠針假單胞菌PchoOl，從浙江省蕭山市番茄根圍分離得到。該菌為革蘭氏陰性菌，無芽孢，單極生鞭毛，能運(yùn)`動。在KMB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后可形成1.2mm菌落，菌落可產(chǎn)生橙色色素，圓形，表面凸起，光滑，較粘稠，易挑起，邊緣整齊(見圖1)。其16S rDNA序列如SEQID N0.1所示,在NCBI進(jìn)行比對結(jié)果顯示其為綠針假單胞菌(Pseudomonas choloraphis)。
[0041]2生防菌劑的制備
[0042]I)將PchoOl菌株接種到LB培養(yǎng)液中，于30°C下，180rpm振蕩培養(yǎng)12~16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；
[0043]LB培養(yǎng)液的配方為:氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為
7.0 ；
[0044]2)當(dāng)培養(yǎng)至0D_值在0.5~0.8之間時，將種子菌液以1:100體積比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液(金氏培養(yǎng)基)的200L發(fā)酵罐中，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)20~24小時，發(fā)酵液pH值維持在7.0，溶氧量20%，通氣量5-7m3/小時，罐壓0.05-0.1KPa0發(fā)酵液出罐后梯度稀釋涂板檢測并調(diào)節(jié)菌懸液濃度約為I X 109CFU/mL,獲得生防菌劑。[0045]金氏培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨2g，甘油10g, K2HPO4L 5g, MgSO4.7Η201.5g，瓊脂15g, pH7.2,10OOmT,水。
[0046]實(shí)施例2Pcho01菌株對禾谷鐮孢菌的拮抗活性
[0047]IPchoOl菌株對禾谷鐮孢菌的平板拮抗活性測定
[0048]用對峙培養(yǎng)法，將保存于4°C中的禾谷鐮孢菌PH-1 (模式菌)接種到PDA平板上活化，待真菌長滿平板后用滅菌的打孔器從菌落外邊緣均勻的打成直徑為6mm的圓形菌塊。將菌絲塊接種在WA平板(WA培養(yǎng)基/L:蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，pH=7.0 )的中心，在其四周距中心約25mm處分別接種PchoOI，試驗(yàn)以清水為對照組。25°C培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后記錄抑菌圈的大小。
[0049]根據(jù)抑菌圈的大小對對PchoOl拮抗禾谷鐮孢菌的活性進(jìn)行評估:0mm,無抑制作用；< 2mm,有輕微的抑制作用中等抑制作用；> 5mm,較強(qiáng)的抑制作用。抑制率根據(jù)式(I)進(jìn)行計(jì)算:
[0050]抑制率=[(R1-R2)/R1]X100% (I);
[0051]其中，Rl為對照病原菌的菌落半徑；R2為病原菌在細(xì)菌方向的菌落半徑。
[0052]檢測結(jié)果見圖2a。由圖2a可見，生防菌PchoOl對禾谷鐮孢菌菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制效果，抑制圈半徑為10mm，菌絲抑制率為76%。與陰性對照清水處理組相比，拮抗效果十分明顯。
[0053]2Pcho01菌株對其他植物病原菌的平板拮抗活性測定
[0054]利用與步驟I相同的方法，檢測PchoOl菌株對番茄枯萎病菌、灰霉病菌、紋枯病菌、玉米小斑病菌、終極腐霉、根霉及青枯病菌的拮抗活性。檢測結(jié)果見圖2b~2h。由圖2b~2h可見，PchoOl菌株對這些病原真菌都具有良好的拮抗效果。
[0055]3Pcho01菌株抑制禾谷鐮孢菌菌絲生長的EC50
[0056]向50°C的WA培養(yǎng)基中加入梯度稀釋的PchoOl菌株，使PchoOl的終濃度依次為107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL,制備含生防菌 PchoOl 的 WA 平板。
[0057]在平板中央接種禾谷鐮孢菌PH-1菌碟，25°C培養(yǎng)至無生防菌WA平板上菌絲長滿平板時統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析(見圖3a和圖3b)，測量含各梯度生防菌平板中PH-1菌落的大小，計(jì)算半最大效應(yīng)濃度(EC50 )。
[0058]由圖3b可見，隨著平板中含菌量的升高，對菌絲抑制率增加。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，平板含菌量與抑制率呈現(xiàn)線性關(guān)系:
[0059]Y=-0.25X+1.975 (R2=0.9593) (2)；
[0060]其中，X為PchoOl菌株濃度Log1(lCFU/mL，Y為PH-1菌落直徑(cm)，R2表示趨勢線的估計(jì)值與對應(yīng)的實(shí)際數(shù)據(jù)之間的擬合程度。
[0061]通過式(2)計(jì)算，當(dāng)平板中PchoOl菌量約為7CFU/mL時，能抑制50%禾谷鐮孢菌菌絲生長，即BSlOl對禾谷鐮孢菌的EC50=7CFU/mL。
[0062]3生防菌劑無菌上清抑制禾谷鐮孢菌菌絲生長的活性
[0063]將實(shí)施例1獲得的生防菌BSlOl菌株發(fā)酵液，10，OOOrpm離心IOmin后取無菌上
清。無菌上清經(jīng)細(xì)菌濾器(0.22 μ m)過濾后待用。
`[0064]向50°C的WA培養(yǎng)基中加入禾谷鐮孢菌PH-1的孢子，至孢子終濃度為IO5個/mL。將含PH-1孢子的WA培養(yǎng)基倒入9cm直徑的平板中，每平板倒入20mL。待冷卻凝固后，用7mm直徑的打孔器在平板的對稱位置打4個孔，每孔分別加入25 μ L制備的無菌上清，以培養(yǎng)液和氰烯菌酯為對照組。25°C靜止培養(yǎng)后觀察抑菌圈。檢測結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，該無菌上清能有有效抑制菌絲生長，抑制圈半徑為5mm。
[0065]4Pcho01發(fā)酵液上清抑制禾谷鐮孢菌孢子萌發(fā)的活性
[0066]在含2%蔗糖的清水、PY79發(fā)酵液上清以及PchoOl發(fā)酵液上清中分別加入終濃度為IO4個/mL的禾谷鐮孢菌PH-1的孢子，每個處理組各取10 μ L孢子懸浮液置于載玻片上(作5次重復(fù))；玻片置于保濕盒中25°C靜止培養(yǎng)，每隔I小時觀察各處理組的孢子萌發(fā)情況，計(jì)算萌發(fā)率。
[0067]由圖5可見，PchoOl發(fā)酵液上清能強(qiáng)烈抑制禾谷鐮孢菌孢子的萌發(fā)，PchoOl發(fā)酵液上清處理的PH-1孢子不能形成芽管。對孢子誘導(dǎo)萌發(fā)，6小時、10小時后分別統(tǒng)計(jì)各處理組的孢子萌發(fā)率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。
[0068]表1.各處理組的禾谷鐮孢菌孢子萌發(fā)率
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種綠針假單胞菌，其特征在于，分類命名為綠針假單胞菌(Pseudomonascholoraphis) PchoOl，保藏號為=CGMCC N0.7729。
2.含有權(quán)利要求1所述綠針假單胞菌的生防菌劑。
3.如權(quán)利要求2所述的生防菌劑，其特征在于，所述綠針假單胞菌的濃度為IX IO9~1010CFU/mL。
4.如權(quán)利要求2或3所述生防菌劑的制備方法，包括:(1)將所述綠針假單胞菌接種于培養(yǎng)液中培養(yǎng)至培養(yǎng)液OD6tltl為0.5~0.8，獲得種子液； (2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)節(jié)發(fā)酵液中綠針假單胞菌的濃度至IX IO9~101QCFU/mL，獲得所述生防菌劑。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述種子液的接種量為I~2%。
6.如權(quán)利要求1所述綠針假單胞菌在拮抗鐮刀菌上的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求1所述綠針假單胞菌在防治小麥赤霉病中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，包括:在小麥齊穗期或揚(yáng)花初期，將綠針假單胞菌菌懸液均勻噴施在小麥穗部；所述綠針假單胞菌菌懸液的濃度為IXlO8~109CFU/mL。
9.如權(quán)利要求1所述綠針假單胞菌在拮抗灰霉病菌、紋枯病菌、玉米小斑病菌、終極腐霉、根霉或青枯病菌上的應(yīng)用。`
【文檔編號】A01P3/00GK103509740SQ201310351388
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月13日
【發(fā)明者】陳云, 尹燕妮, 馬忠華 申請人:浙江大學(xué)