植物種子接種禾草內(nèi)生真菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了可以用于農(nóng)業(yè)育種技術(shù)的接種方法，即通過植物種子接種禾草內(nèi)生真菌的方法。本發(fā)明的方案包括接種針的處理，培養(yǎng)瓶的準(zhǔn)備，植物種子的處理，接種，幼苗管理和內(nèi)生真菌的檢測等步驟，將帶有內(nèi)生真菌菌絲和孢子的接種針刺穿植物種子，并將種子放置在內(nèi)生真菌菌落上萌發(fā)，使內(nèi)生真菌侵染并進(jìn)入植物種子和幼苗，從而達(dá)到接種的效果。操作簡單，成功率高，有效提高育種選育效率，可以服務(wù)于各類型種子公司和品種選育機(jī)構(gòu)，用于新優(yōu)良品種的選育和市場化。
【專利說明】植物種子接種禾草內(nèi)生真菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種通過植物種子接種禾草內(nèi)生真菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]禾草內(nèi)生真菌(grassendophyte, fungal endophyte, endophytic fungi)是指生長在植株體內(nèi)并完成全部或大部生活周期，而禾草不顯示外部癥狀的一大類真菌。很多禾草內(nèi)生真菌與宿主植物互利共生，為植物帶來多種有益性能，如抗蟲能力、抗旱能力、抗寒能力、抗病能力、抗線蟲能力，還能促進(jìn)植物的生長、分蘗，提高植物的競爭能力，促進(jìn)苗期生長和恢復(fù)再生，促進(jìn)植物對磷的利用，促進(jìn)植物對土壤殘留有效磷和氮素的利用，而且還能提高光合作用，提高植物的產(chǎn)量。國際上通過接種禾草內(nèi)生真菌到經(jīng)濟(jì)型禾本科植物中，獲得了許多優(yōu)良的草坪草、牧草等品種，如著名牧草葦狀羊茅Kentuky31等，改善了草坪、草場等的品質(zhì)，并且創(chuàng)造出巨大的經(jīng)濟(jì)利益。
[0003]由于自然界的禾草內(nèi)生真菌具有極高的宿主特異性，所以只有通過人工接種才能創(chuàng)造新的“禾草內(nèi)生真菌-植物”組合，進(jìn)而篩選出具有更高經(jīng)濟(jì)價值的草坪草、牧草等品種。目前，國際上常用的接種方法是“植物幼苗生長點(diǎn)接入禾草內(nèi)生真菌法”，即暗室培養(yǎng)禾草幼苗迫使其生長點(diǎn)上移，在顯微鏡下找到植物生長點(diǎn)后用接種針將禾草內(nèi)生真菌菌絲塞入植物生長點(diǎn)。
[0004]然而，“植物幼苗生長點(diǎn)接入禾草內(nèi)生真菌法”嚴(yán)重破壞植物。通過暗室培養(yǎng)和接種針損害的幼苗往往因為自身的損傷不能正常生長發(fā)育而表現(xiàn)出病態(tài)，大多數(shù)情況沒有體現(xiàn)禾草內(nèi)生真菌的功能。而且，此方法操作周期長，技術(shù)要求高，接種成功率只在3/100左右，限制了通過接種禾草內(nèi)生真菌改良禾本科經(jīng)濟(jì)作物的育種工作的進(jìn)度。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于為利用禾草內(nèi)生真菌資源改良禾本科經(jīng)濟(jì)作物的育種工作提供一種通過植物種子接種禾草內(nèi)生真菌的方法，將帶有內(nèi)生真菌菌絲和孢子的接種針刺穿植物種子，并將種子放置在內(nèi)生真菌菌落上萌發(fā)，使內(nèi)生真菌侵染并進(jìn)入植物種子和幼苗，從而達(dá)到接種的效果。
[0006]采用本發(fā)明提供的“植物種子接種禾草內(nèi)生真菌的方法”接種后的植株，經(jīng)過內(nèi)生真菌檢測,植株群特性分析，E+和E-群落形狀對比等方法，評估內(nèi)生真菌對于植物生長的作用，挑選具有優(yōu)良農(nóng)藝形狀的“禾草內(nèi)生真菌-植物”組合，同時淘汰無益無效甚至有害的組合，提高育種選育效率；此外，該方法不破壞植物幼苗正常生長，操作簡單周期短，成功率高，可以服務(wù)于各類型種子公司和品種選育機(jī)構(gòu)，用于新優(yōu)良品種的選育和市場化。
【具體實施方式】
[0007]1.接種針處理:
[0008]選取不銹鋼接種針若干，放置于直徑90mm的玻璃平皿中，高壓蒸汽滅菌鍋120°C處理40min后放入無菌操作臺冷卻待用。在保持接種針韌性的前提下殺死接種針上的微生物，防止其攜帶的微生物污染植物種子，影響植物生長。
[0009]2.培養(yǎng)瓶準(zhǔn)備:
[0010]選取培養(yǎng)瓶，每個瓶中放入適量內(nèi)生真菌培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌鍋120°C處理40min,冷卻后在無菌操作臺接種禾草內(nèi)生真菌,待內(nèi)生真菌生長3_15天時將接種針轉(zhuǎn)移到菌落上，每個菌落一根接種針，使真菌菌絲和孢子散落到接種針上。
[0011]3.植物種子處理:
[0012]選取飽滿的植物種子若干，每20粒放置在一個250ml錐形瓶中，分別經(jīng)過50%硫酸，20%酒精處理，無菌水清洗后，排列在90mm玻璃平皿內(nèi)放入無菌操作臺待用。硫酸和酒精處理時間需要根據(jù)植物種子情況而定，保證種子存活前提下殺死盡可能多的微生物。
[0013]4.接種:
[0014]在無菌操作臺，利用無菌鑷子將接種針取出，刺穿植物種子后放回培養(yǎng)瓶內(nèi)內(nèi)生真菌菌落上繼續(xù)培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶密封后放入培養(yǎng)箱中，使種子正常發(fā)芽生長。
[0015]5.幼苗管理:
[0016]每天觀察種子發(fā)芽和生長情況，及時清理雜菌。植物幼苗生長2-3天后移栽到盆中，定期澆水施肥。植物幼苗長至高度1cm左右時，將其移栽到田間，任其自然生長繁殖。
[0017]6.內(nèi)生真菌檢測:
[0018]收集成熟植物種子和莖桿。選取部分種子和莖桿用于檢測。種子孟加拉紅染液處理后壓片，在顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌菌絲體。莖桿刮取其髓質(zhì)染色，在顯微鏡下觀察菌絲體。從而獲得接種成功的植株和種子。
【權(quán)利要求】
1.一種通過植物種子接種禾草內(nèi)生真菌的方法，其特征是將接種針刺穿植物種子，并將種子放置在內(nèi)生真菌菌落上萌發(fā)，使內(nèi)生真菌侵染并進(jìn)入植物種子和幼苗，從而達(dá)到接種的效果，有效淘汰無效無益組合，提高選育效率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述接種方法，其特征是:接種針刺穿植物種子前放置在內(nèi)生真菌菌落上，其表面沾有內(nèi)生真菌菌絲和孢子。
【文檔編號】A01G7/06GK104335832SQ201310339584
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月5日
【發(fā)明者】車瑾瑜 申請人:車瑾瑜