專利名稱：一種玉米胚三重接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種玉米胚三重接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是一種通過(guò)對(duì)玉米種胚進(jìn)行針刺接種并輔以接種液真空浸泡、接種液常壓浸泡強(qiáng)化侵染的轉(zhuǎn)基因接種技術(shù)。
背景技術(shù)：
玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)是采用生物技術(shù)方法改造玉米品種，培育具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗蟲(chóng)、抗病等優(yōu)良特性新品種的最為有效的技術(shù)手段。目前玉米的轉(zhuǎn)基因一般都采用農(nóng)桿菌侵染愈傷的方法，該方法先要進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，然后農(nóng)桿菌侵染，再用組織培養(yǎng)的方法獲得轉(zhuǎn)基因苗。由于玉米組織培養(yǎng)難度較大，因此該方法的效率較低，應(yīng)用困難。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用一種新的技術(shù)路線進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)基因的接種處理，以期達(dá)到方法易行，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，效果良好的技術(shù)效果。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的1.一種玉米胚三重接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于，對(duì)玉米種子的胚進(jìn)行針刺接種、抽真空浸泡接種、常壓浸泡接種等復(fù)合處理措施，使之充分侵染。它包括①玉米種子消毒、②無(wú)菌水浸種、③刺胚接種、④接種液抽真空浸泡接種、⑤接種液常壓浸泡接種、⑥暗箱培養(yǎng)6個(gè)步驟。2.玉米種 子消毒選取飽滿的玉米種子順序用乙醇、84消毒液消毒，之后用滅菌水洗盡消毒液。3.無(wú)菌水浸種將種子轉(zhuǎn)入滅菌水中30°C浸泡24小時(shí)，使種子充分吸脹并萌動(dòng)。4.刺胚接種將萌動(dòng)的種子取出置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用鋼針蘸取0D_為O. 6的已轉(zhuǎn)入雙元載體的農(nóng)桿菌接種液扎刺胚芽和胚根。5.接種液抽真空浸泡接種將刺完的種子放在含有煙草葉提取物和400 μ mol/L乙酰丁香酮的已轉(zhuǎn)入雙元載體的農(nóng)桿菌接種液中浸泡，22°C抽真空(-0.1MPa) 30min。6.接種液常壓浸泡接種氣壓恢復(fù)正常后，將種子放在接種液中繼續(xù)浸泡3hr。7.暗箱培養(yǎng)將處理好的種子置于發(fā)芽盒中，22°C恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)3天即可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。本發(fā)明的有益效果一種玉米胚三重接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)避開(kāi)了傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌侵染愈傷后再組織培養(yǎng)的技術(shù)路線，與現(xiàn)有方法相比有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)第一，所需時(shí)間減少2-3個(gè)月。農(nóng)桿菌侵染法從愈傷誘導(dǎo)到獲得轉(zhuǎn)基因植株一般需要3-4個(gè)月，本方法從接種開(kāi)始到鑒定完成只需一個(gè)星期；第二，本方法對(duì)技術(shù)要求不高。玉米組織培養(yǎng)難度大，愈傷易褐化，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)者的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)的條件要求高，而本方法不涉及組織培養(yǎng)過(guò)程，因此大大降低了技術(shù)難度和實(shí)驗(yàn)條件；第三，本方法所需費(fèi)用較少，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)需要借助植物組織培養(yǎng)技術(shù)，而組織培養(yǎng)的各種試劑較貴，而且需要建立組培室并配備大量的儀器設(shè)備才能開(kāi)展工作，而本發(fā)明免除了這部分的花費(fèi)，節(jié)約了大量資金。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1 :將1305GFP載體轉(zhuǎn)入到玉米自交系植株中1.玉米種子消毒選取400粒飽滿的玉米自交系N108首先用70%乙醇消毒3min，然后用84消毒液消毒40min，消毒結(jié)束后用滅菌水漂洗3_4次，完全洗凈消毒液。2.無(wú)菌水浸種將N108種子轉(zhuǎn)入滅菌水中30°C浸泡24小時(shí)，充分吸脹并萌動(dòng)。3.刺胚接種將萌動(dòng)的N108種子取出置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用鋼針蘸取OD6c 為
O.6的已轉(zhuǎn)入1305GFP雙元載體的農(nóng)桿菌接種液刺胚芽和胚根。5.接種液抽真空浸泡接種將刺完的種子放在含有煙草葉提取物和400 μ mol/L乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌接種液中浸泡，22°C抽真空(-0.1MPa) 30min。6.接種液常壓浸泡接種氣壓恢復(fù)正常后，將種子放在接種液中繼續(xù)浸泡3hr。7.暗箱培養(yǎng)將處理好的N108種子置于發(fā)芽盒中，22°C恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)3天即可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。通過(guò)以上步驟在114株N108幼苗中獲取了 3株轉(zhuǎn)基因植株。歷時(shí)8天，比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)減少80天左右。實(shí)施例2 :將1305GFP載體轉(zhuǎn)入到雜交玉米的植株中1.玉米種子消毒選取400粒飽滿的玉米雜交種鳳玉13首先用70%乙醇消毒3min，然后用84消毒液消毒40min，消毒結(jié)束后用滅菌水漂洗3_4次，完全洗凈消毒液。2.無(wú)菌水浸種將鳳玉13種子轉(zhuǎn)入滅菌水中30°C浸泡24小時(shí)，充分吸脹并萌動(dòng)。3.刺胚接種將萌動(dòng)的鳳玉13種子取出置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用鋼針蘸取0D_為O. 6的已轉(zhuǎn)入1305GFP雙元載體的農(nóng)桿菌接種液刺胚芽和胚根。4.接種液抽真空浸泡接種將刺完的種子放在含有煙草葉提取物和400 μ mol/L乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌接種液中浸泡，22°C抽真空(-0.1MPa) 30min。5.接種液常壓浸泡接種氣壓恢復(fù)正常后，將種子放在接種液中繼續(xù)浸泡3hr。6.暗箱培養(yǎng)將處理好的鳳玉13種子置于發(fā)芽盒中，22°C恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)3天即可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。通過(guò)以上步驟共獲得73株玉米幼苗，經(jīng)檢測(cè)，其中I株為轉(zhuǎn)基因植株。歷時(shí)8天，比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)減少80天左右。
權(quán)利要求
1.一種玉米胚三重接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于，對(duì)玉米種子的胚進(jìn)行針刺接種、抽真空浸泡接種、常壓浸泡接種等復(fù)合處理措施，使之充分侵染，它包括①玉米種子消毒，②無(wú)菌水浸種，③刺胚接種，④接種液抽真空浸泡接種，⑤接種液常壓浸泡接種，⑥暗箱培養(yǎng)6個(gè)步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于，所述的玉米種子消毒的做法是選取飽滿的玉米種子順序用乙醇、84消毒液消毒，之后用滅菌水洗盡消毒液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于，所述的無(wú)菌水浸種的做法是將種子轉(zhuǎn)入滅菌水中30°C浸泡24小時(shí)，使種子充分吸脹并萌動(dòng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于，所述的刺胚接種的做法是將萌動(dòng)的種子取出置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用鋼針蘸取0D600為O. 6的已轉(zhuǎn)入雙元載體的農(nóng)桿菌接種液扎刺胚芽和胚根。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于，所述的接種液抽真空浸泡接種的做法是將刺完的種子放在含有煙草葉提取物和400ymol/L乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌接種液中浸泡，22 °C 抽真空(-O. lMPa)30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于，所述的接種液常壓浸泡接種的做法是氣壓恢復(fù)正常后，將種子放在接種液中繼續(xù)浸泡3hr。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于，所述的暗箱培養(yǎng)的做法是將處理好的種子置于發(fā)芽盒中，22°C恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)3天即可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。
全文摘要
一種玉米胚三重接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。將玉米種子消毒、浸泡后進(jìn)行刺胚接種、接種液抽真空浸泡接種、接種液常壓浸泡接種，使之充分侵染，再對(duì)種子進(jìn)行暗箱培養(yǎng)，促進(jìn)農(nóng)桿菌侵染并在體內(nèi)大量增殖擴(kuò)散，3天后即可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定。本方法簡(jiǎn)便，操作容易，費(fèi)用低廉。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103031333SQ20131001903
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2013年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月19日
發(fā)明者王麗華, 李杰勤, 劉正, 王茂輝, 萬(wàn)海波, 周青 申請(qǐng)人:安徽科技學(xué)院