控制植物葉片轉(zhuǎn)綠的基因及其使用方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】控制植物葉片轉(zhuǎn)綠的基因及其使用方法和應(yīng)用，本發(fā)明公開了通過促進(jìn)或抑制EMB2279基因或其蛋白來調(diào)節(jié)植物葉綠體成熟的方法及其應(yīng)用。所述方法可用于控制植物葉片轉(zhuǎn)綠性狀。本發(fā)明的EMB2279基因或其蛋白及方法對于植物培植領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良農(nóng)作物或者園藝植物提供了很好的基因資源。
【專利說明】控制植物葉片轉(zhuǎn)綠的基因及其使用方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地說，本發(fā)明涉及利用EMB2279基因及其蛋白控制植物葉片轉(zhuǎn)綠的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場所，因此，改進(jìn)葉綠體的功能，例如增強(qiáng)或促進(jìn)葉綠體的活性對于提高農(nóng)作物，特別是糧食作物產(chǎn)量或者經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量有極其重要的意義。
[0003]目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要是通過延緩葉綠體衰老的途徑來提高作物產(chǎn)量。由于葉綠體發(fā)育受到包括低溫、陰雨等環(huán)境因子的影響，如果植物能在各種逆境條件下都能保障葉綠體順利發(fā)育，必將有利于植物的生長。但實(shí)際生產(chǎn)中尚未展開這樣的應(yīng)用研究。其次，各種不同類型的質(zhì)體，包括葉綠體也是許多營養(yǎng)物質(zhì)積累的場所，例如氨基酸、維生素、抗氧化劑等等，因此調(diào)控葉綠體發(fā)育也與品質(zhì)密切相關(guān)。但是，迄今還沒有運(yùn)用生物技術(shù)調(diào)控葉綠體發(fā)育來提高作物品質(zhì)的先例。例如，某些蔬菜栽培中，為了使葉綠體退化變成黃化質(zhì)體，往往采用，諸如培土、遮光等傳統(tǒng)手段，而這些傳統(tǒng)的栽培措施往往具有成本過高、操作繁瑣、結(jié)果不穩(wěn)定、成功率不高等等缺點(diǎn)。因此，如果能通過調(diào)控植物體內(nèi)本身關(guān)鍵基因表達(dá)就能改變?nèi)~綠體發(fā)育的狀態(tài)，就可以簡單、高效實(shí)現(xiàn)作物的品質(zhì)改良。
[0004]另外，在園藝觀賞植物中，觀葉植物也是越來越受到人們的重視。目前，這些觀賞植物都是從自然突變體或者通過人工誘變后篩選獲得的突變體。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，通過轉(zhuǎn)基因定向培育植物新品種具有快速、效率高等特點(diǎn)。
[0005]因此，本領(lǐng)域急需能夠控制葉綠體的成熟程度，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的產(chǎn)量以及葉片顏色等各種性狀的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供調(diào)控植物葉綠體成熟的方法。
[0007]在第一方面，本發(fā)明提供EMB2279基因或其蛋白在調(diào)控植物葉綠體成熟中的應(yīng)用。
[0008]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述植物包括十字花科、禾本科、豆科、脂麻科、菊科、藜科、山茶科、菌草科、梧桐科、爺科、五加科、多孔菌科、百合科、殼斗科、棕櫚科、龍舌蘭科。
[0009]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述植物包括:擬南芥(Arabidopsis thaliana)、小麥、水稻、玉米、燕麥、黑麥、大麥、粟、高粱、青稞、棉花、麻類、花生、油菜、芝麻、大豆、向日葵、甜菜、甘蔗、茶葉、咖啡豆、可可、煙草、人參、靈芝、貝母、橡膠、椰子、油棕和劍麻。
[0010]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是調(diào)節(jié)植物葉片顏色。
[0011]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，EMB2279蛋白包括
[0012](a)如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的蛋白；或
[0013](b)將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述蛋白的功能的由(a)衍生的蛋白。
[0014]在第二方面，本發(fā)明提供調(diào)控植物葉綠體成熟的方法，所述方法包括以下步驟:
[0015]a)將促進(jìn)或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)的物質(zhì)給予植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官；和
[0016]b)培養(yǎng)步驟a)獲得的植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官。
[0017]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述促進(jìn)EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)是指與對照相比，EMB2279基因或其蛋白的表達(dá)量升高或過表達(dá)，或表達(dá)活性更高的蛋白變體；所述拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)是指與對照相比，EMB2279基因或其蛋白的表達(dá)量降低或不表達(dá)，或表達(dá)活性降低或無活性的EMB2279蛋白。
[0018]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述促進(jìn)或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)的物質(zhì)包括:EMB2279基因本身、EMB2279基因的反義RNA或EMB2279蛋白的抗體。
[0019]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)的物質(zhì)是SEQ IDNO:3 所不的 microRNA。
[0020]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟a)是將編碼EMB2279蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官，獲得轉(zhuǎn)化入編碼EMB2279蛋白的多核苷酸的植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官。
[0021]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟a)是將植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官與攜帶含有編碼EMB227 9蛋白的多核苷酸的農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)接觸，從而使編碼EMB2279蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并整合到植物細(xì)胞的染色體上。
[0022]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法用于調(diào)節(jié)植物葉片的顏色變化。
[0023]在第三方面，本發(fā)明提供EMB2279基因或其蛋白在篩選植物葉綠體成熟促進(jìn)劑或拮抗劑中的應(yīng)用。
[0024]在第四方面，本發(fā)明提供篩選植物葉綠體成熟促進(jìn)劑或拮抗劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0025]a)將待測物質(zhì)給予某植物；
[0026]b)檢測該植物中EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)情況；
[0027]如果與未給予待測物質(zhì)的對照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)上調(diào)，則所述待測物質(zhì)是葉綠體成熟促進(jìn)劑；
[0028]如果與未給予待測物質(zhì)的對照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)下調(diào)，則所述待測物質(zhì)是葉綠體成熟拮抗劑。
[0029]在第五方面，本發(fā)明提供一種植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞中EMB2799蛋白的編碼基因失活。
[0030]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過基因剔除、基因中斷或基因插入造成EMB2799基因失活。
[0031]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的失活還包括EMB2799基因不表達(dá)，或表達(dá)沒有活性的EMB2799蛋白。
[0032]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
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【附圖說明】
[0033]圖1顯示了野生型擬南芥(WT)和突變型擬南芥(130)的表型、130圖位克隆結(jié)果、誤剪切產(chǎn)物、130T-DNA插入突變體emb2279-l表型以及emb2279_l與130等位測試結(jié)果。
[0034]圖2顯示了在突變型擬南芥中轉(zhuǎn)化野生型的EMB2279基因后獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥(35S:EMB2279/130)，在野生型擬南芥中轉(zhuǎn)入干擾野生型擬南芥中EMB2279基因表達(dá)的干擾分子后獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥(Am1-EMB2279/Col)的表型。
[0035]圖3顯示了擬南芥AtEMB2279_GFP融合蛋白定位于葉綠體中。
[0036]圖4顯示了野生型擬南芥以及AtEMB2279功能缺失的突變型擬南芥的葉綠體超微結(jié)構(gòu)。
[0037]圖5顯示了野生型擬南芥以及AtEMB2279功能缺失的突變型擬南芥光和特性的比較。
[0038]圖6顯示了擬南芥EMB2279的靶標(biāo)。
[0039]圖7顯示了在突變型擬南芥中轉(zhuǎn)化EMB2279-GFP (35S:EMB2279_GFP/130)以及EMB2279-FLAG (35S:EMB2279_FLAG/130)后獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型。
【具體實(shí)施方式】
[0040]發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)EMB2279基因與植物的葉片轉(zhuǎn)綠過程以及葉綠體的成熟相關(guān)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)EMB2279蛋白是定位于葉綠體中的特異性加工葉綠體基因表達(dá)的調(diào)控因子，利用EMB2279基因可調(diào)節(jié)植物葉片顏色性狀。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。`
[0041]植物
[0042]本文所用的術(shù)語“植物”是指可以借助光合作用，以水、二氧化碳和無機(jī)鹽等無機(jī)物合成碳水化合物、蛋白質(zhì)等來維系生存，并通常不發(fā)生移動的生物。在具體的實(shí)施方式中，本文所述的“植物”通常包括糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物。所述糧食作物指以收獲成熟果實(shí)為目的，經(jīng)去殼、碾磨等加工程序而成為人類基本食糧的一類作物，例如谷類作物、薯類作物和豆類作物。而所述經(jīng)濟(jì)作物，又稱技術(shù)作物、工業(yè)原料作物，其指具有某種特定經(jīng)濟(jì)用途的農(nóng)作物，包括蔬菜、瓜果、花卉等園藝作物。
[0043]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文所述的“植物”包括但不限于:十字花科、豆科、脂麻科、菊科、藜科、山茶科、菌草科、梧桐科、爺科、五加科、多孔菌科、百合科、殼斗科、棕櫚科、龍舌蘭科。
[0044]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文所述的“植物”包括但不限于:擬南芥(Arabidopsis thaliana)、小麥、水稻、玉米、燕麥、黑麥、大麥、粟、高粱、青稞、棉花、麻類、花生、油菜、芝麻、大豆、向日葵、甜菜、甘蔗、茶葉、咖啡豆、可可、煙草、人參、靈芝、貝母、橡月父、挪子、油掠和劍麻，等等。
[0045]鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，本文所述的植物是其中的EMB2279基因或其蛋白的表達(dá)或活性得到抑制或增強(qiáng)的植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)明白，除了成體植物本身，本文所述的植物還包括植物種子、植物細(xì)胞、植物組織或器官。
[0046]在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物包括:轉(zhuǎn)入了 EMB2279基因或其同源基因的轉(zhuǎn)基因植物；或者EMB2279蛋白表達(dá)量降低(包括低表達(dá)或不表達(dá))或表達(dá)無活性EMB2279蛋白的植物，等等。
[0047]EMB2279基因及其蛋白
[0048]在本發(fā)明中，術(shù)語“EMB2279蛋白”指具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。然而，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)以及現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)明白該術(shù)語包括EMB2279蛋白的變異形式，所述變異形式具有與EMB2279蛋白相同或相似的功能，但其氨基酸序列與SEQID N0:2所示氨基酸序列有少量差異。這些變異形式包括(但不限于):一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1_8個、1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或多個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代，例如，異亮氨酸與亮氨酸相互取代時，不會改變所得蛋白質(zhì)的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸，例如為便于分離而添加的標(biāo)簽通常不會改變所得蛋白質(zhì)的功能。
[0049]多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)格性條件下能與EMB2279蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗EMB2279蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含EMB2279蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 EMB2279蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有EMB2279蛋白序列的至少約20個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
[0050]發(fā)明還提供EMB2279蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然EMB2279蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
[0051]修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括:體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
[0052]在本發(fā)明中，“ΕΜΒ2279蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID Ν0:2所示氨基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
[0053]因此，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)，例如下表所示進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生保守性變異的突變體。
[0054]
【權(quán)利要求】
1.EMB2279基因或其蛋白在調(diào)控植物葉綠體成熟中的應(yīng)用。
2.一種調(diào)控植物葉綠體成熟的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: a)將促進(jìn)或拮抗EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)的物質(zhì)給予植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官；和 b)培養(yǎng)步驟a)獲得的植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟a)是將編碼EMB2279蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官，獲得轉(zhuǎn)化入編碼EMB2279蛋白的多核苷酸的植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟a)是將植物、植物種子、植物細(xì)胞、組織或器官與攜帶含有編碼EMB2279蛋白的多核苷酸的農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)接觸，從而使編碼EMB2279蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并整合到植物細(xì)胞的染色體上。
5.EMB2279基因或其蛋白在篩選植物葉綠體成熟促進(jìn)劑或拮抗劑中的應(yīng)用。
6.一種篩選植物葉綠體成熟促進(jìn)劑或拮抗劑的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: a)將待測物質(zhì)給予某植物； b)檢測該植物中EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)情況； 如果與未給予待測物質(zhì)的對照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)上調(diào)，則所述待測物質(zhì)是葉綠`體成熟促進(jìn)劑； 如果與未給予待測物質(zhì)的對照植物相比，所述EMB2279基因或其蛋白的活性或表達(dá)下調(diào)，則所述待測物質(zhì)是葉綠體成熟拮抗劑。
7.一種植物細(xì)胞，其特征在于，所述植物細(xì)胞中EMB2799蛋白的編碼基因失活。
【文檔編號】A01H5/00GK103865936SQ201210536969
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月12日
【發(fā)明者】黃繼榮, 黃偉華, 吳文娟 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院