專利名稱：一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
精液冷凍保存與人工授精技術(shù)相結(jié)合，在現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著巨大的作用，能大量減少公畜的飼養(yǎng)數(shù)量，降低生產(chǎn)成本，提高優(yōu)秀種公畜的利用率，為畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益?，F(xiàn)階段，驢繁殖主要采用本交方式，個別技術(shù)好的畜牧改良員有時也將采出的精液(鮮精)不稀釋或低倍稀釋(I 2 4)，立即給發(fā)情母驢輸精，它適用于母驢季節(jié)性發(fā)情較明顯，而且數(shù)量較多的地區(qū)。與本交相比，效率可提高5 — 20倍。但由于我國驢品種較多，養(yǎng)殖區(qū)分布較廣，多在山區(qū)或交通不便區(qū)域，且飼養(yǎng)方式多以散戶居多，母驢分布不集中，鮮精或低倍稀釋的精液人工授精技術(shù)推廣面積較少。此外，由于驢鮮精體外保存時間極短，幾小時后活力近乎喪失，這使得驢的鮮精人工授精技術(shù)受到時間、地點(diǎn)的極大限制。因此，畜牧生產(chǎn)中迫切需要保存時間更長、攜帶更為方便的優(yōu)質(zhì)公驢精液來改良全社會的驢生產(chǎn)群體。精液保存分為常溫(15 °C 25 °C)保存、低溫保存(0°C 5°C)和冷凍(一79V 一196°C)保存三種方法。常溫保存技術(shù)研究開展的最早，相對比較成熟，但在常溫下，一方面微生物生長迅速會影響精液質(zhì)量，另一方面常溫保存時精子活力下降較快。低溫保存技術(shù)相對冷凍保存而言操作簡單方便，成本低，但低溫保存技術(shù)需要既能提供營養(yǎng)又能保護(hù)精子的非滲透性低溫保護(hù)劑及稀釋液。冷凍保存是指將精液經(jīng)過特殊處理后置于液氮或干冰中，可保存該物種種質(zhì)資源數(shù)年甚至數(shù)十年，切實(shí)發(fā)揮良種公畜的遺傳資源。但由于不同公畜精子的生物學(xué)特性不同，其冷凍保存效果也存在很大的差別。如牛精液的冷凍保存技術(shù)比較成熟，尤其牛精液細(xì)管法程序生產(chǎn)已經(jīng)普及；但羊精子凍后普遍存在情期受胎率不穩(wěn)定、受胎率低、重復(fù)率低等諸多問題；而豬的精子因含脂量較高，脫水比較困難，冷凍-解凍后精子存在超微結(jié)構(gòu)受到損傷(如精子膜、頂體和精子核泡化、損傷或破裂)、在雌性生殖道內(nèi)壽命縮短和受精率低等問題，因而豬精液冷凍保存還一直處于試驗(yàn)階段。目前國內(nèi)外關(guān)于驢精液冷凍保存的研究很少，主要原因是一方面是驢的繁殖率低，妊娠期長；第二，由于不同的驢個體間其精液品質(zhì)有明顯的差異，且驢精子本身對低溫打擊特別敏感，在冷凍解凍過程中極易損傷，因而冷藏和冷凍后的精液極大地降低了受胎率；第三，由于驢發(fā)情時間長，人工授精的時機(jī)掌握不準(zhǔn)確造成其妊娠率低；最后，公驢每次平均射精量多達(dá)70ml，密度較稀，且精清中的電解質(zhì)成分會促進(jìn)精子早衰。因而，驢的冷凍精液生產(chǎn)操作程度復(fù)雜，難度大，嚴(yán)重制約著冷凍精液的應(yīng)用。驢為馬屬動物，分布其廣，遍及亞、非、拉各大洲。我國的德州驢，體格高大，結(jié)構(gòu)勻稱，中外馳名，是改良小型驢種及作為種間 雜交的一個理想品種。因此生產(chǎn)中亟需進(jìn)行德州驢精液的冷凍保存研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑，解決了現(xiàn)有技術(shù)中母畜繁殖周期長、人工授精受胎率低，驢的冷凍精液生產(chǎn)操作程度復(fù)雜，難度大的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1樣酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黃10 30mL、青霉素45 55萬IU、鏈霉素4. 5 5. 5萬IU、余量為蒸餾水。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分Tris 3. 5g、葡萄糖1. 5g、朽1檬酸2. 0g、甘油7mL、卵黃20mL、青霉素50萬IU、鏈霉
素5萬IU、余量為蒸懼水。本發(fā)明提出又一種制備用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑的方法，包括步驟I)按照每IOOmL抗凍劑中包含Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黃10 30mL、青霉素45 55萬IU、鏈霉素4. 5 5. 5萬IU、余量為蒸餾水，稱取各組分，備用；2)將上述稱取的Tris、葡萄糖、檸檬酸用蒸餾水配置成基礎(chǔ)液；3)向上述配置成的基`礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素鈉和硫酸鏈霉素配置成I液；4)將所述I液整pH為7.1 7. 8，然后進(jìn)行過濾滅菌，放入3 5°C冰箱中備用；5)使用前取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，按照每IOOmL抗凍劑中包含Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、檸檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黃10 30mL、青霉素45 55萬IU、鏈霉素4. 5 5. 5萬IU、余量為蒸懼水,稱取各組分,備用。由于采用了上述技術(shù)方案，一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑及其制備方法，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黃10 30mL、青霉素45 55萬IU、鏈霉素4. 5 5. 5萬IU、余量為蒸餾水，解決了現(xiàn)有技術(shù)中母畜繁殖周期長、人工授精受胎率低，驢的冷凍精液生產(chǎn)操作程度復(fù)雜，難度大的問題。具體實(shí)驗(yàn)卵黃的取用鴨蛋應(yīng)來源于無疫病的鴨場，且所使用鴨蛋須新鮮、完整、干凈，取用卵黃前先用75%酒精棉球?qū)Φ皻け砻孢M(jìn)行消毒，待酒精揮發(fā)盡后用蛋清分離器取出完整的卵黃；也可在鴨蛋腰中線處敲開一裂紋，將鴨蛋一分兩半，利用二個蛋殼交替傾倒的方法，除去蛋清，留下卵黃；然后用滅菌的注射器穿過卵黃膜抽取卵黃。驢冷凍精液抗凍劑的制備方法用電子分析天平準(zhǔn)確稱取Tris 3. 5g、葡萄糖2g、檸檬酸2. Og將其溶解于50mL蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌均勻后，配置成IOOmL基礎(chǔ)液。在基礎(chǔ)液中添加5萬IU的青霉素鈉、硫酸鏈霉素，配置成I液；用精密pH計(jì)調(diào)整pH為7. 3,然后用0. 22iim的濾膜進(jìn)行過濾除菌，放入4°C冰箱中備用。在進(jìn)行驢精液冷凍前，取360mL I液加入80mL卵黃，用封口膜封好口后，上下顛倒混勻，于4°C冰箱中過夜，分層。第二天，吸去表層雜質(zhì)，將抗凍劑中層倒入燒杯中，棄去下層沉淀。稀釋液經(jīng)4000rpm/min離心3次,每次30min,去除離心后的稀釋液表層雜質(zhì)及底層沉淀，取中層倒入鹽水瓶或藍(lán)口瓶中，加入20mL甘油，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，配置成II液，置于4°C冰箱中待用。I液配好后，可在4°C冰箱中存放約10天。II液現(xiàn)用現(xiàn)配，在4°C冰箱中存放時間不宜超過24h。實(shí)驗(yàn)例以德州驢精液冷凍保存進(jìn)行說明。(一)抗凍劑的配制用電子分析天平準(zhǔn)確稱取Tris 3. 36g、葡萄糖1. 53g、檸檬酸1. 88g，將其溶解于50mL蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌均勻后，配置成IOOmL基礎(chǔ)液。在基礎(chǔ)液中添加5萬IU的青霉素鈉、硫酸鏈霉素，配置成I液；用精密pH計(jì)調(diào)整pH為7. 5,然后用0. 22iim的濾膜進(jìn)行過濾除菌，放入4°C冰箱中備用。在進(jìn)行驢精液冷凍前，取360mL I液加入80mL卵黃，用封口膜封好口后，上下顛倒混勻，于4°C冰箱中過夜，分層。第二天，吸去表層雜質(zhì)，將抗凍劑中層倒入燒杯中，棄去下層沉淀。稀釋液經(jīng)4000rpm/min離心3次,每次30min,去除離心后的稀釋液表層雜質(zhì)及底層沉淀，取中層倒入鹽水瓶或藍(lán)口瓶中，加入25. 4mL甘油，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，配置成II液，置于4°C冰箱中待用。I液配好后，可在4°C冰箱中存放約10天。II液現(xiàn)用現(xiàn)配，在4°C冰箱中存放時間不宜超過24h。(二)精液的采集利用假陰道法采集公驢精液，采集精液用8層無菌紗布過濾后，立即在配有38°C恒溫裝置的相差顯微鏡上鏡檢，評定精子活力，并用精子密度儀測量精子密度。所采集的精液為乳白色或灰白色，無異味，精子形態(tài)正常，密度正常，且在I億/ml以上，活力在0.7以上的方可用于制作細(xì)管冷凍精液。(三)精液冷凍將用含有甘油的II液稀釋的精液快速裝管(0.5ml)細(xì)管，封口完畢后在4°C冰箱或恒溫箱中平衡3-4h。平衡完畢后，將細(xì)管碼放在冷凍架上，碼放時應(yīng)注意細(xì)管擺放方向，使棉塞封口段靠近操作者。每架上放上一根類似于細(xì)管的標(biāo)記物，一頭驢用一個標(biāo)記物，便于識別。如同一架上有不同驢的細(xì)管精液，要分開碼放，兩頭驢之間要隔開一些距離，以免混淆。待冷凍儀溫度降到約4°C后，將碼放好的細(xì)管移入冷凍儀中，按照預(yù)先設(shè)定好的冷凍溫度曲線，自動完成冷凍過程。(四)細(xì)管凍精的解凍及凍后活率鑒定預(yù)先將恒溫水浴鍋中的水溫加熱至38°C，用鑷子將一支超低溫冷凍的細(xì)管從液氮中迅速取出后，投入38°C水浴中搖晃約30s，待完全溶解后立即取出，用紗布擦干水珠，再用細(xì)管剪先剪去超聲波封口端，再剪去棉塞端，將細(xì)管內(nèi)的精液全部置于一小試管內(nèi)，搖勻，取一滴于載玻片上，并蓋上蓋玻片，在配有38°C恒溫裝置的相差顯微鏡上鏡檢，評定精液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。(五)冷凍精液品質(zhì)鑒 定1.精子頂體完整性檢測。采用FITC標(biāo)記的花生凝集素染色后，用熒光顯微鏡檢測冷凍-解凍后的精子頂體的完整性。取30 UL解凍后的細(xì)管精液涂片，之后自然風(fēng)干。自然干燥后的抹片在20-22°C的甲醇中浸泡lOmin，固定。然后在每個風(fēng)干后的抹片上滴上含有100mg/mL的FITC標(biāo)記的花生凝集素的染液，放置在37°C的暗濕盒中染色30min。之后，用PBS沖洗，風(fēng)干抹片后，滴加抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片，用無色指甲油封片后，在熒光顯微鏡下檢查精子頂體的狀況。2.精子DNA完整性檢測。利用吖啶橙(AO)染色后，用熒光顯微鏡檢測冷凍-解凍后的精子DNA的完整性。用TNE緩沖液將解凍后的精液稀釋至適宜濃度，之后，取200 ii L稀釋后的精液立即加入400 ii L去垢劑。30s后，加入1.2mLA0染料染色。染色后，取15 y L精液滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。根據(jù)精子頭部顏色判定精子DNA是完整或是降解。3.精子線粒體活性檢測。利用羅丹明123 (R123)與碘化丙啶(PI)染色后，用熒光顯微鏡檢測冷凍-解凍后的精子線粒體活性。用PBS將解凍后的精液稀釋至適宜濃度，取ImL稀釋后的精液加入1. 5mL離心管中，向其中加入3 ii L羅丹明123。將離心管放置在37°C的暗濕盒中20min，之后，加入10 y L碘化丙啶，置于37°C的暗濕盒中孵育lOmin。之后，精液經(jīng)600Xg離心6min。離心后，去上清，用ImLPBS重懸下層精子團(tuán)塊。取10 y L重懸后的精液滴在載玻片上，再滴加IOy L抗熒光淬滅劑。將玻片置于熒光顯微鏡下觀察。根據(jù)精子顯示顏色，判斷精子線粒體活性。4.精子質(zhì)膜完整性檢測。利用低滲膨脹實(shí)驗(yàn)(HOST)檢測精子質(zhì)膜的完整性。取50 ii L解凍后的精液加入ImL的低滲溶液中?；靹蚝?，置于37°C孵育60min，之后，取15 y L精液樣品滴加在載玻片上，加上蓋玻片后，根據(jù)精子尾部是否卷曲，判斷精子質(zhì)膜是否完
難
iF. O(六)人工授精 試驗(yàn)將上述研制的冷凍精液解凍后人工輸入發(fā)情母驢體內(nèi)，配妊率為54. 8%，達(dá)到了鮮精配種效果。(七)評定結(jié)果應(yīng)用本發(fā)明的抗凍劑以及精液的冷凍-解凍方法，其評定結(jié)果如下1.冷凍-解凍后精子的活率達(dá)到40%以上；2.精子的頂體完整率達(dá)到84%以上；3.每劑細(xì)管中有效精子數(shù)不少于3000萬個；4.有活性線粒體的精子達(dá)到13%以上；5.精子的質(zhì)膜完整率達(dá)到38%以上。
為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明的制備方法的工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。如圖1所示，一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1樣酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黃10 30mL、青霉素45 55萬IU、鏈霉素4. 5 5. 5萬IU、余量為蒸餾水。一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分Tris 3. 5g、葡萄糖1. 5g、朽1檬酸2. 0g、甘油7mL、卵黃20mL、青霉素50萬IU、鏈霉素5萬IU、余量為蒸懼水。一種制備用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑的方法，包括步驟I)按照每IOOmL抗凍劑中包含Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黃10 30mL、青霉素45 55萬IU、鏈霉素4. 5 5. 5萬IU、余量為蒸餾水，稱取各組分，備用；2)將上述稱取的Tris、葡萄糖、檸檬酸用蒸餾水配置成基礎(chǔ)液；3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素鈉和硫酸鏈霉素配置成I液；4)將所述I液整p H為7.1 7. 8，然后進(jìn)行過濾滅菌，放入3 5°C冰箱中備用；5)使用前取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑。按照每IOOmL抗凍劑中包含Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、梓檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黃10 30mL、青霉素45 55萬IU、鏈霉素4. 5 5. 5萬IU、余量為蒸餾水，稱取各組分，備用。實(shí)施例一I)按照每IOOmL抗凍劑中包含Tris 3g、葡萄糖lg、朽1檬酸1. 5g、甘油5mL、卵黃10mL、青霉素45萬IU、鏈霉素4. 5萬IU、余量為蒸懼水,稱取各組分,備用；2)將上述稱取的Tris、葡萄糖、檸檬酸用蒸餾水配置成基礎(chǔ)液；3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素鈉和硫酸鏈霉素配置成I液；4)將所述I液整pH為7. 1，然后進(jìn)行過濾滅菌，放入3°C冰箱中備用；5)使用前取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑。實(shí)施例二I)按照每IOOmL抗凍劑中包含Tris 3. 5g、葡萄糖1. 5g、朽1檬酸2. 0g、甘油7mL、卵黃20mL、青霉素50萬IU、鏈霉素5萬IU、余量為蒸餾水，稱取各組分，備用；2)將上述稱取的Tris、葡萄糖、檸檬酸用蒸餾水配置成基礎(chǔ)液；3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素鈉和硫酸鏈霉素配置成I液；4)將所述I液整pH為7. 5，然后進(jìn)行過濾滅菌，放入4°C冰箱中備用；5)使用前取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑。實(shí)施例三I)按照每IOOmL抗凍劑中包含Tris 4g、葡萄糖2. 5g、朽1檬酸3. 0g、甘油10mL、卵黃30mL、青霉素55萬IU、鏈霉素5. 5萬IU、余量為蒸餾水，稱取各組分，備用；2)將上述稱取的Tris、葡萄糖、檸檬酸用蒸餾水配置成基礎(chǔ)液；3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素鈉和硫酸鏈霉素配置成I液；4)將所述I液整pH為7. 8，然后進(jìn)行過濾滅菌，放入5°C冰箱中備用；5)使用前取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改`、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑，其特征在于，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分 Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1樣酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黃10 30mL、青霉素45 55萬IU、鏈霉素4. 5 5. 5萬IU、余量為蒸懼水。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑，其特征在于，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分 Tris 3. 5g、葡萄糖1. 5g、朽1檬酸2. 0g、甘油7mL、卵黃20mL、青霉素50萬IU、鏈霉素5萬IU、余量為蒸懼水。
3.一種制備如權(quán)利要求1所述的用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑的方法，其特征在于，包括步驟 1)按照每IOOmL抗凍劑中包含Tris3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黃10 30mL、青霉素45 55萬IU、鏈霉素4. 5 5. 5萬IU、余量為蒸餾水，稱取各組分，備用； 2)將上述稱取的Tris、葡萄糖、檸檬酸用蒸餾水配置成基礎(chǔ)液； 3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素鈉和硫酸鏈霉素配置成I液； 4)將所述I液整pH為7.1 7. 8，然后進(jìn)行過濾滅菌，放入3 5°C冰箱中備用； 5)使用前取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑。
4.如權(quán)利要求3所述的一種制備用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑的方法，其特征在于按照每IOOmL抗凍劑中包含Tris 3 4g、葡萄糖I 2. 5g、朽1檬酸1. 5 3. 0g、甘油5 10mL、卵黃10 30mL、青霉素45 55萬IU、鏈霉素4. 5 5. 5萬IU、余量為蒸餾水，稱取各組分，備用。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種用于驢精液冷凍保存的鴨蛋卵黃抗凍劑及其制備方法，每100mL抗凍劑中包括下列組分Tris 3～4g、葡萄糖1～2.5g、檸檬酸1.5～3.0g、甘油5～10mL、卵黃10～30mL、青霉素45～55萬IU、鏈霉素4.5～5.5萬IU、余量為蒸餾水，解決了現(xiàn)有技術(shù)中母畜繁殖周期長、人工授精受胎率低，驢的冷凍精液生產(chǎn)操作程度復(fù)雜，難度大的問題。
文檔編號A01N1/02GK103039434SQ20121052907
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者王長法, 張燕, 王玲玲, 朱濤濤, 張瑞濤, 鞠志花, 黃金明, 高運(yùn)東, 仲躋峰, 侯明海, 王銀朝, 閆金華 申請人:山東天龍牧業(yè)科技有限公司, 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心