專利名稱：一種提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法。
背景技術(shù)：
水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)屬木犀科白臘樹屬，是我國東北重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)用樹種之一。水曲柳材質(zhì)優(yōu)良，強(qiáng)度適中，紋理美觀，木材利用價值極高，是著名的軍事用材和高級家具用材，與胡桃楸、黃菠蘿同稱為“東北三大硬闊”。同時，水曲柳是東北林區(qū)頂級群落紅松針闊混交林的重要伴生樹種之一。然而，水曲柳的資源歷來非常缺乏，カロ之長期的過渡采伐和不合理利用，其資源已將近枯竭，生態(tài)環(huán)境問題日益嚴(yán)重。另外水曲柳母樹結(jié)實情況受環(huán)境條件影響很大，種子的供應(yīng)常有不足。水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)為解決水曲柳種子匱乏和水曲柳優(yōu)良品系種質(zhì)保存 的問題提供了ー個重要的方法和手段。然而水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生還存在很多困難，比如體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)換率低等問題。目前，水曲柳胚性組織的誘導(dǎo)主要是利用未成熟合子胚(以授粉后9周左右采集的未成熟合子胚為最佳外植體)，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率平均在30 35%。并且存在外植體取材時期受季節(jié)(毎年7月中旬左右，即授粉后9周)和地點(水曲柳母樹林或種子園)限制、外植體來源不足(水曲柳母樹結(jié)實具有大小年和結(jié)實間隔期)等問題。若采用成熟合子胚為外植體，則具有易于取材、不受時間地點限制等優(yōu)點，易于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化繁殖。但在現(xiàn)有的技術(shù)中，以水曲柳成熟合子胚為外植體的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率最高才15 %，不能滿足水曲柳體細(xì)胞胚大規(guī)模誘導(dǎo)和培養(yǎng)的需求,無法實現(xiàn)水曲柳體細(xì)胞胚的エ廠化和自動化生產(chǎn)。因此，迫切需要改進(jìn)現(xiàn)有的水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)技木，以提高水曲柳體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率，實現(xiàn)水曲柳優(yōu)良品系的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化繁殖。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)中存在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率低、外植體取材受季節(jié)和地點限制、外植體來源不足的問題，而提供一種提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法。提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法按以下步驟實現(xiàn)一、取水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含I. 0 2. Omg/L芐基腺嘌呤(BA)、2. 5 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、75 125g/L蔗糖和6 7g/L瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為20 30°C、濕度為40% 70%、無光照的條件下培養(yǎng)2 4周，得胚性組織；ニ、將胚性組織接種到含0 2. Omg/L芐基腺嘌呤、0 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、20 30g/L蔗糖和6 7g/L瓊脂的繼代培養(yǎng)基中，在溫度為20 30°C、濕度為40% 70%、無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 4周，得各種不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚，即完成提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法；其中步驟一中誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS1/2培養(yǎng)基或WPM培養(yǎng)基，pH值均為5 6 ;
步驟一中生長素為2，4- ニ氯苯氧こ酸(2，4_D)或萘こ酸(NAA)；步驟ニ中繼代培養(yǎng)基為MS1/2培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基，pH值均為5 6 ;步驟ニ中生長素為2，4_ ニ氯苯氧こ酸或萘こ酸。本發(fā)明中提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法成本低、操作簡單，通過調(diào)節(jié)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的蔗糖濃度或甘露醇濃度，可調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，進(jìn)而實現(xiàn)對水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率提高的物理調(diào)控，使體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率提高到70%以上(現(xiàn)有的技術(shù)中以水曲柳成熟合子胚為外植體的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率最高才15% )，單個外植體上的體細(xì)胞胚數(shù)量達(dá)70個以上。本發(fā)明可以實現(xiàn)提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率、増加體細(xì)胞胚數(shù)量、提高繁殖效率 的目標(biāo)，而且本發(fā)明具有外植體來源廣泛，包括新采集的成熟種子、經(jīng)過各種方法貯藏不同時間的成熟種子均可作為外植體、外植體取材不受季節(jié)和地點限制的特點。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法按以下步驟實現(xiàn)一、取水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含I. 0 2. Omg/L芐基腺嘌呤、2. 5 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、75 125g/L蔗糖和6 7g/L瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為20 30°C、濕度為40% 70%、無光照的條件下培養(yǎng)2 4周，得胚性組織；ニ、將胚性組織接種到含0 2. Omg/L芐基腺嘌呤、0 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、20 30g/L蔗糖和6 7g/L瓊脂的繼代培養(yǎng)基中，在溫度為20 30°C、濕度為40% 70%、無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 4周，得各種不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚，即完成提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法；其中步驟一中誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS1/2培養(yǎng)基或WPM培養(yǎng)基，pH值均為5 6 ;步驟一中生長素為2，4_ ニ氯苯氧こ酸或萘こ酸；步驟ニ中繼代培養(yǎng)基為MS1/2培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基，pH值均為5 6 ;步驟ニ中生長素為2，4_ ニ氯苯氧こ酸或萘こ酸。本實施方式步驟*中水曲柳成熟種子為毎年9月下旬至10月下旬采集的成熟種子或采集后經(jīng)過不同方法貯藏后的水曲柳成熟種子；本實施方式中步驟一中誘導(dǎo)培養(yǎng)基滲透壓的調(diào)節(jié)是通過在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加75 125g/L鹿糖或添加20 30g/L鹿糖和55 140g/L甘露醇實現(xiàn)的。本實施方式中誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基均經(jīng)過121°C滅菌20min，自然冷卻。本實施方式步驟一中MS1/2培養(yǎng)基為所有元素含量都減半的MS培養(yǎng)基。本實施方式中涉及的MS培養(yǎng)基、MS1/2培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基的成分如表I所示。表I
具體實施方式
ニ 本實施方式與具體實施方式
一的不同是，步驟一中水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理的方法剝除包被在種子外面的果皮，流水沖洗種子20 40min，然后在25 30°C的室溫下將種子在水中浸泡2 3天,每天換一次水；然后在超凈工作臺上用體積濃度為70 % 80 %的酒精浸泡種子30 120s，然后用體積濃度為2 % 6 %的NaClO溶液浸泡種子10 20min進(jìn)行體表滅菌，再用無菌水沖洗浸泡后的種子3 7次。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同是，步驟一中剝離出合子胚的方法在超凈工作臺上用無菌解剖刀在成熟種子的胚根端切去1/3 1/2，用鑷子從切ロ處擠出成熟合子胚，切取成熟合子胚的單片子葉接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，且子葉內(nèi)側(cè)附于培養(yǎng)基上。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同是，步驟一中切取合子胚的單片子葉還可以接種到含I. 0 2. Omg/L芐基腺嘌呤、2. 5 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、20 30g/L蔗糖55 140g/L甘露醇和6 7g/L瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同是，步驟ニ中在溫 度為24°C、濕度為50%、無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)3周，得各種不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。實施例I :提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法按以下步驟實現(xiàn)一、取水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含2. Omg/L芐基腺嘌呤、5. 0mg/L2,4- ニ氯苯氧こ酸、400mg/L酸性水解酪蛋白、75g/L蔗糖和6g/L瓊脂的MS1/2培養(yǎng)基中，在溫度為25°C、濕度為70%、無光照的條件下培養(yǎng)3周，得胚性組織；ニ、將胚性組織接種到含2. Omg/L芐基腺嘌呤、400mg/L酸性水解酪蛋白、25g/L蔗糖和6g/L瓊脂的MS1/2培養(yǎng)基中，在溫度為25°C、濕度為70%、無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)2周，得各種不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚，即完成提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法。本實施例中MS1/2培養(yǎng)基的pH值為5。本實施例中水曲柳成熟種子為10月上旬采集的成熟種子；本實施例中水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理的方法剝除包被在種子外面的果皮，流水沖洗種子40min，然后在25°C的室溫下將種子在水中浸泡2天,每天換一次水；然后在超凈工作臺上用體積濃度為75%的酒精浸泡種子30s，然后用體積濃度為2%的NaClO溶液浸泡種子IOmin進(jìn)行體表滅菌，再用無菌水沖洗浸泡后的種子5次。本實施例中剝離出合子胚的方法在超凈工作臺上用無菌解剖刀在成熟種子的胚根端切去1/3，用鑷子從切ロ處擠出成熟合子胚，切取成熟合子胚的單片子葉接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，且子葉內(nèi)側(cè)附于培養(yǎng)基上。本實施例中水曲柳體細(xì)胞胚的最高誘導(dǎo)率可達(dá)75%，單個外植體上的體細(xì)胞胚數(shù)量可達(dá)71個。實施例2:提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法按以下步驟實現(xiàn)一、取水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含L Omg/L芐基腺嘌呤、2. 5mg/L萘こ酸、500mg/L酸性水解酪蛋白、80g/L蔗糖和7g/L瓊脂的WPM培養(yǎng)基中，在溫度為20°C、濕度為50%、無光照的條件下培養(yǎng)4周，得胚性組織；ニ、將胚性組織接種到含I. Omg/L芐基腺嘌呤、I. Omg/L萘こ酸、500mg/L酸性水解酪蛋白、20g/L蔗糖和6g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中，在溫度為20°C、濕度為50%、無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4周，得各種不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚，即完成提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法。
本實施例中WPM培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基的pH值均為6。本實施例中水曲柳成熟種子為10月上旬采集的成熟種子；本實施例中水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理的方法剝除包被在種子外面的果皮，流水沖洗種子40min，然后在25°C的室溫下將種子在水中浸泡2天,每天換一次水；然后在超凈工作臺上用體積濃度為75%的酒精浸泡種子30s，然后用體積濃度為2%的NaClO溶液浸泡種子15min進(jìn)行體表滅菌，再用無菌水沖洗浸泡后的種子5次。本實施例中剝離出合子胚的方法在超凈工作臺上用無菌解剖刀在成熟種子的胚根端切去1/2，用鑷子從切ロ處擠出成熟合子胚，切取成熟合子胚的單片子葉接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，且子葉內(nèi)側(cè)附于培養(yǎng)基上。本實施例中水曲柳體細(xì)胞胚的最高誘導(dǎo)率可達(dá)74%，單個外植體上的體細(xì)胞胚數(shù)量可達(dá)70個。 實施例3 提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法按以下步驟實現(xiàn)一、取水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含2. Omg/L芐基腺嘌呤、4. 0mg/L2,4- ニ氯苯氧こ酸、700mg/L酸性水解酪蛋白、125g/L蔗糖和6g/L瓊脂的MS1/2培養(yǎng)基中，在溫度為30°C、濕度為70%、無光照的條件下培養(yǎng)2周，得胚性組織；ニ、將胚性組織接種到含5. Omg/L萘こ酸、600mg/L酸性水解酪蛋白、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中，在溫度為30°C、濕度為70%、無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)2周，得各種不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚，即完成提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法。本實施例中MS培養(yǎng)基和MS1/2培養(yǎng)基的pH值均為6。本實施例中水曲柳成熟種子為10月上旬采集的成熟種子；本實施例中水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理的方法剝除包被在種子外面的果皮，流水沖洗種子40min，然后在25°C的室溫下將種子在水中浸泡2天,每天換一次水；然后在超凈工作臺上用體積濃度為75%的酒精浸泡種子30s，然后用體積濃度為2%的NaClO溶液浸泡種子20min進(jìn)行體表滅菌，再用無菌水沖洗浸泡后的種子5次。本實施例中剝離出合子胚的方法在超凈工作臺上用無菌解剖刀在成熟種子的胚根端切去1/2，用鑷子從切ロ處擠出成熟合子胚，切取成熟合子胚的單片子葉接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，且子葉內(nèi)側(cè)附于培養(yǎng)基上。本實施例中水曲柳體細(xì)胞胚的最高誘導(dǎo)率可達(dá)73%，單個外植體上的體細(xì)胞胚數(shù)量可達(dá)70個。實施例4 提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法按以下步驟實現(xiàn)一、取水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含I. Omg/L芐基腺嘌呤、2. 5mg/L萘こ酸、400mg/L酸性水解酪蛋白、25g/L蔗糖100g/L甘露醇和7g/L瓊脂的WPM培養(yǎng)基中，在溫度為30°C、濕度為70%、無光照的條件下培養(yǎng)2周，得胚性組織；ニ、將胚性組織接種到含1.01^/1芐基腺嘌呤、2.011^/12，4-ニ氯苯氧こ酸、500mg/L酸性水解酪蛋白、20g/L蔗糖和6g/L瓊脂的MS1/2培養(yǎng)基中，在溫度為30°C、濕度為70%、無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)2周，得各種不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚，即完成提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法；本實施例中WPM培養(yǎng)基和MS1/2培養(yǎng)基的pH值均為6。本實施例中水曲柳成熟種子為10月上旬采集的成熟種子；本實施例中水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理的方法剝除包被在種子外面的果皮，流水沖洗種子40min，然后在25°C的室溫下將種子在水中浸泡2天,每天換一次水；然后在超凈工作臺上用體積濃度為75%的酒精浸泡種子30s，然后用體積濃度為2%的NaClO溶液浸泡種子IOmin進(jìn)行體表滅菌，再用無菌水沖洗浸泡后的種子5次。本實施例中剝離出合子胚的方法在超凈工作臺上用無菌解剖刀在成熟種子的胚根端切去1/3，用鑷子從切ロ處擠出成熟合子胚，切取成熟合子胚的單片子葉接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，且子葉內(nèi)側(cè)附于培養(yǎng)基上。
本實施例中水曲柳體細(xì)胞胚的最高誘導(dǎo)率可達(dá)75%，單個外植體上的體細(xì)胞胚數(shù)量可達(dá)72個。
權(quán)利要求
1.一種提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法，其特征在于它按以下步驟實現(xiàn) 一、取水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含I. O 2. Omg/L芐基腺嘌呤、2. 5 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、75 125g/L蔗糖和6 7g/L瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為20 30°C、濕度為40% 70%、無光照的條件下培養(yǎng)2 4周，得胚性組織； ニ、將胚性組織接種到含0 2. Omg/L芐基腺嘌呤、0 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、20 30g/L蔗糖和6 7g/L瓊脂的繼代培養(yǎng)基中，在溫度為20 30°C、濕度為40% 70%、無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 4周，得各種不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚，即完成提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法； 其中步驟一中誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS1/2培養(yǎng)基或WPM培養(yǎng)基，pH值均為5 6 ; 步驟一中生長素為2，4- ニ氯苯氧こ酸或萘こ酸； 步驟ニ中繼代培養(yǎng)基為MS1/2培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基，pH值均為5 6 ; 步驟ニ中生長素為2，4_ ニ氯苯氧こ酸或萘こ酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法，其特征在于步驟一中水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理的方法剝除包被在種子外面的果皮，流水沖洗種子20 40min,然后在25 30°C的室溫下將種子在水中浸泡2 3天,姆天換一次水；然后在超凈工作臺上用體積濃度為70% 80%的酒精浸泡種子30 120s，然后用體積濃度為2% 6%的NaClO溶液浸泡種子10 20min進(jìn)行體表滅菌，再用無菌水沖洗浸泡后的種子3 7次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法，其特征在于步驟一中剝離出合子胚的方法在超凈工作臺上用無菌解剖刀在成熟種子的胚根端切去1/3 1/2，用鑷子從切ロ處擠出成熟合子胚，切取成熟合子胚的單片子葉接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，且子葉內(nèi)側(cè)附于培養(yǎng)基上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法，其特征在于步驟一中切取合子胚的單片子葉還可以接種到含I. 0 2. Omg/L芐基腺嘌呤、2. 5 5. 0mg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、20 30g/L蔗糖和55 140g/L甘露醇、6 7g/L瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法，其特征在于步驟ニ中在溫度為24°C、濕度為50%、無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)3周，得各種不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚。
全文摘要
一種提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法，它涉及一種提高體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法。它要解決現(xiàn)有水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)中存在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率低、外植體取材受季節(jié)和地點限制、外植體來源不足的問題。方法一、取水曲柳成熟種子消毒后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得胚性組織；二、胚性組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，即完成。本發(fā)明成本低、操作簡單，使體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率提高到70％以上，單個外植體上的體細(xì)胞胚數(shù)量達(dá)70個以上。本發(fā)明可以實現(xiàn)提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率、增加體細(xì)胞胚數(shù)量、提高繁殖效率的目標(biāo)，而且本發(fā)明具有外植體來源廣泛，包括新采集的成熟種子、經(jīng)過各種方法貯藏不同時間的成熟種子均可作為外植體、外植體取材不受季節(jié)和地點限制的特點。
文檔編號A01H4/00GK102948369SQ20121049349
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者楊玲 申請人:東北林業(yè)大學(xué), 楊玲