一種用于提高荷斯坦公牛x精子凍后品質的冷凍稀釋液配方的制作方法

專利名稱：一種用于提高荷斯坦公牛x精子凍后品質的冷凍稀釋液配方的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種奶牛人工授精的改良技術，尤其涉及一種用于提高荷斯坦公牛X精子凍后品質的冷凍精液稀釋液配方。
背景技術：
家畜精液的冷凍成功為人工授精技術的發(fā)展產生了極其深遠的影響，首先為擴大優(yōu)秀種公畜的利用率和延長利用時間奠定了基礎，其次為人工授精和低溫生物學的發(fā)展提供了廣闊的空間。由于冷凍精液在運輸上比較方便，不論從時間還是從空間上，都使種公畜的配種效能得到充分發(fā)揮，加速了家畜品種改良的步伐。但是，不同性別的動物可以滿足人們不同方面的需要，所以人們?yōu)榱俗陨硇枰獣ㄟ^各種辦法去干預動物的正常生殖過程，使成年雌性動物生產出人們期望的性別后代，因而動物的性別差異直接影響其市場價值?！ひ虼?，性別控制技術在畜牧業(yè)生產中意義重大。在奶牛的生產中，目前已經實現(xiàn)X精子和Y精子的分離，通過人工授精成功的實現(xiàn)了對荷斯坦牛的性別控制。但現(xiàn)今荷斯坦牛性控冷凍精液解凍后的活力及受精率與鮮精相比還有很大差異，研究開發(fā)更有效的牛性控精液冷凍保護劑，提高性控精子凍后活力等具有重要的意義。在性控精液的x、Y精子分離過程中，獲得經檢測合格后的鮮精要經過染色、分離、平衡、離心、XY精子分離，稀釋、分裝、冷凍等一系列過程，這些程序會對精子造成一定的損傷，造成精子死亡及活力降低，嚴重影響精液品質，最終影響受精率，其中冷凍精液的稀釋液配方是非常重要的影響因素。因此，根據(jù)目前的趨勢，利用實驗室條件對奶牛的性控精液稀釋液配方進行深入研究，開發(fā)出新的精液稀釋液，這樣既可以提高荷斯坦牛X精子凍融后的存活率及受精率，又加快了我國奶牛的改良力度，為迅速提高奶牛的改良和產奶量，增加奶牛業(yè)的經濟效益，拉動地方和區(qū)域經濟發(fā)展具有積極的作用。以下是申請人檢索的相關參考文獻lMustafa S, Eserlf D. The effect of ascorbic acid on thefreezabiIity of ram semen diluted with extenders containing differentproportions of glycerolJ· Turkish Jourmal of Verterinary & animalScience, 2004，28(5) :893_910。2SinghB，Chand D. Siquality of deep frozen murrah buffalobull (Bubalus bubali s)semenJ· Journal of Pairying Food & HomeSciences, 1997，14(4) : 253-259。3Dawson，E.B.，Harris，W. A. , Teterj M. C. , Powel 1，L. C.，1992. Effectof ascorbic acid supplementation on the sperm quality of smokers. Fertil.Steril. 58，1034 - 1039。4Partida SLG, Setchell BP, Maxwell W M. Epididymal compounds and antioxidants in diluents for the frozen storage of ram spermatozoaJ·ReprodFertil Dev，1997，9(7):689_696。5FooteR H，Brockett C C，Kaproth M T. Motility and fertility of bullsperm in whole milk extender containing antioxidantsJ· Anim Reprod Sci，2002，71(1-2):13-23。6JonesR， Mann T.Damage to ram spermatozoa by peroxidantion ofendogenous phospholipids [J] . J Reprod Fertil，1997，50 (2):261-26。[7]Mustafa S,Esref D.The effect of ascorbic acid on the freezability ofram semen diluted with extenders containing different proportions of glycerolJ·Turkish Journal of Veterinary & Animal Science，2004，28 (5):893-910。8Aitken R J，Clarkson J S. Cellular basis of defective sperm functionand its association with the genesis of reactive oxygen species by humanspermatozoa [J] . J Reprod Fertil，1998，81:459-469.9Martia，L Mara b，J. I. Marti c，T. Seasonal variations in antioxidantenzyme activity in ram seminal plasma EJ· Theriogenology 67(2007) 1446 - 1454。[ IOjMedearos CMOj Forell Fj Oliveira ATD，et al. Current status of spermcrypereseration:Why isn’ t it better [ J].Theriogenologyj 2002, 57 :327 344。llUkeda H，Maeda S，Ishii T，Sawamura M. Spectrophotometric assay forsuperoxide dismutase basedon tetrazolium salt 3’_{1_(Phenylamino)-carbonyl-34-tetrazolium}-bis(4-methoxy-6-nitro)benzenesulphonic acid hydrate reductionby xanthinexanthine oxidase. Anal Biochem 1997 ；251 :206_209o12]TaleviR， Pelosi S，Sansone G，et al. Effects of different pre-freezingrates on buffalo sperm Motility and ultrastructure preservation [J]·Buffalo. 1999 (43) :537_539。13
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發(fā)明內容
針對X精子在冷凍過程中由于其處理方式與普通精液冷凍前處理方式相比，程序繁瑣復雜，處理時間相對較長，處理過程中精子死亡率較高，導致精子活力低，配種后妊娠率低的缺陷，本發(fā)明的目的在于，提供一種用于提高荷斯坦牛X精子冷凍精液凍融后品質及受精率的新型精液稀釋液配方。該稀釋液可以明顯提高分離以后的X精子凍后活率和頂體完整率及其他相關指標，從而提聞X精子凍融后的品質及受:精率。為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采取如下的技術解決方案一種用于提高荷斯坦公牛X精子凍后品質的冷凍稀釋液配方，其特征在于，制得的該冷凍稀釋液每100毫升中含有以下物質檸檬酸鈉0. 9 I. 2克，蔗糖3 6克，低密度脂蛋白16_18毫克，甘油4 7暈升，維生素E 500暈克 700暈克，維生素B12 100暈克 200暈克，壯觀霉素0. 35暈克，慶大霉素-J 8萬單位(IU)，蒸餾水補足100毫升。本發(fā)明一個優(yōu)選的配方，100毫升冷凍稀釋液中各物質含量為檸檬酸鈉I. 073毫克，蔗糖4. 3毫克，低密度脂蛋白16毫克，甘油6毫升，維生素E600毫克，維生素B12150毫克，壯觀霉素0. 35毫克，慶大霉素8萬單位(IU)。上述用于提高荷斯坦公牛X精子凍后品質的冷凍稀釋液的配制方法，其特征在于，按下列步驟進行I)準確稱取配方量的檸檬酸鈉、蔗糖、低密度脂蛋白、維生素E、維生素B12和甘油，加蒸餾水至100毫升，在磁力攪拌器上攪動60分鐘充分攪拌均勻，然后放入4°C冰箱過夜；2)精液稀釋前加入壯觀霉素和慶大霉素并攪拌10分鐘，用酸或堿調整稀釋液的酸堿度，用PH計測定稀釋液的pH在6. 5 7. 5之間，然后用O. 22微米濾器對稀釋液進行慮菌處理，慮菌處理后放入37. 5°C水浴鍋中備用。
本發(fā)明首次把維生素E，維生素B12，加入到了冷凍稀釋液中，并對冷凍稀釋液的配制方法做了修正，實驗數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的于提高荷斯坦公牛X精子凍后品質的冷凍稀釋液，提聞了 X精子凍融后的活力和精子頂體完整率，提聞了精子凍后品質。
具體實施例方式按照本發(fā)明的技術方案，本實施例給出一種用于提高荷斯坦公牛X精子凍后品質的冷凍稀釋液，制得的該冷凍稀釋液每100毫升中含有以下物質檸檬酸鈉0. 9 I. 2克，蔗糖3 6克，低密度脂蛋白16_18毫克，甘油4 7暈升，維生素E 500暈克 700暈克，維生素B12 100暈克 200暈克，壯觀霉素0. 35暈克，慶大霉素-J 8萬單位(IU)，蒸餾水補足100毫升。其配制方法是I、稱取原料檸檬酸鈉，蔗糖，低密度脂蛋白，甘油，維生素E，維生素B12，蒸餾水。2、將以上的檸檬酸鈉，蔗糖，低密度脂蛋白，維生素E，維生素B12,甘油，用蒸餾水配置成基礎液，用磁力攪拌器攪拌60分鐘，4°C冰箱內過夜備用。3、在精液稀釋前加入慶大霉素，壯觀霉素，然后在磁力攪拌器攪拌10分鐘。4、用酸或堿調整稀釋液pH值為6. 5 7. 5，然后用O. 22微米過濾器慮菌，慮菌后放入37. 5 °C水浴鍋中備用。使用時，把經過預處理并由流式細胞儀分離后的X Y精子存放在裝有已制備好的冷凍稀釋液中，平衡五分鐘后檢查精子活力，活力正常的按照普通精液制作方法開始制作冷凍精液。并做好相關記錄。本試驗中，測定上述冷凍稀釋液與傳統(tǒng)配方的性控精液解凍后在A級精子百分率、B級精子百分率、頂體完整率、平均路徑速度、平均移動角度、曲線運動速度、直線性、擺動性測擺幅度，直線運動速度進行比較。A級精子百分率、B級精子百分率、頂體完整率、平均路徑速度、平均移動角度、曲線運動速度、直線性、擺動性測擺幅度，直線運動速度采用精子自動分析儀進行自動分析。頂體完整率及檢測方法如下(I)精液解凍后立即在35°C 37°C的溫度下進行活率檢查。評定時，用玻璃棒蘸取I滴精液，滴于載玻片上，加上蓋玻片，使蓋玻片和載玻片之間充滿精液，然后置于400倍 600倍顯微鏡下觀察。在顯微鏡視野中，通過對精液上、中、下三層液面精子活動情況綜合觀察，評定精子活率。(2)取一滴解凍后的精液滴在干凈的載玻片上，用另一載玻片呈45度，將精液抹向另一側，制成抹片。自然風干后用I 2毫升福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定15分鐘，水洗干燥后用姬姆薩染色90分鐘，然后除去抹片上的染液，風干后置于1000倍生物顯微鏡下觀察500個精子，記錄精子總數(shù)和頂體完整精子數(shù)，最后得到頂體完整率。
以下是發(fā)明人給出的具體試驗實施例，試驗選用體質健壯、性欲旺盛的成年荷斯坦種公牛，按種公牛飼養(yǎng)管理要求進行飼養(yǎng)，其采精頻率為每周3次。利用假陰道采集法采集公牛精液，精液采集后，立即在35°C 37°C下鏡檢。所采集的精液為乳白色或乳黃色，無異味，精子形態(tài)正常，活率達到O. 7以上方可用于制作冷凍精液。試驗按照不申請的技術方案設置了三個不同配方，并和傳統(tǒng)配方進行了比較。配方I :配制100毫升冷凍稀釋液檸檬酸鈉O. 9毫克，蔗糖3. 3毫克，低密度脂蛋白16暈克,甘油5暈升,維生素E 500暈克,維生素B12IOO暈克,壯觀霉素O. 35暈克,慶大霉素8萬單位(IU)。配方2 :配制100毫升冷凍稀釋液檸檬酸鈉I. O毫克，蔗糖4. 3毫克，低密度脂蛋白17暈克,甘油6暈升,維生素E 600暈克,維生素B12150暈克,壯觀霉素O. 35暈克,慶大霉素8萬單位(IU)。配方3 :配制100毫升冷凍稀釋液檸檬酸鈉I. I毫克，蔗糖5. 3毫克，低密度脂蛋·白18暈克,維生素E 700暈克,維生素B12 200暈克；甘油7暈升,壯觀霉素O. 35暈克,慶大霉素8萬單位(IU)。傳統(tǒng)配方配制100毫升稀釋液檸檬酸鈉I. 2毫克，蔗糖6. 3毫克，卵黃20毫升，甘油5暈升,壯觀霉素O. 35暈克，慶大霉素8萬單位(IU)。嚴格按以上配方稱取稱取所含成分，加蒸餾水至100毫升。在磁力攪拌器上攪動60分鐘充分攪拌均勻，然后放入4°C冰箱過夜。精液稀釋前加入壯觀霉素O. 35毫克，慶大霉素8萬單位(IU)并攪拌10分鐘。用酸或堿調整稀釋液的酸堿度，用PH計測定稀釋液PH在6. 7 7. 2之間。用O. 22微米濾器對稀釋液進行慮菌處理，完畢后放入37. 5°C水浴鍋中備用。然后按照性控精液制作方法進行制作即可，解凍后用精子自動分析儀檢測精液品質，具體指標見下表不同配方冷凍精液稀釋液對凍融后X精子品質的影響(平均數(shù)土標準差)
權利要求
1.一種用于提高荷斯坦公牛X精子凍后品質的冷凍稀釋液，其特征在于，制得的該冷凍稀釋液每100毫升中含有以下物質 檸檬酸鈉0. 9 I. 2克，蔗糖3 6克，低密度脂蛋白16-18毫克，甘油4 7毫升，維生素E 500毫克 700毫克，維生素B12 100毫克 200毫克，壯觀霉素0. 35毫克，慶大霉素-J 8萬單位(IU)，蒸餾水補足100毫升。
2.如權利要求I所述的用于提高荷斯坦公牛X精子凍后品質的冷凍稀釋液，其特征在于，制得的該冷凍稀釋液每100毫升中含有以下物質 檸檬酸鈉1. 073毫克，蔗糖4. 3毫克，低密度脂蛋白16毫克，甘油6毫升，維生素E 600毫克，維生素B12 150毫克，壯觀霉素0. 35毫克，慶大霉素8萬單位(IU)，蒸餾水補足100暈升。
3.權利要求I或2所述的用于提高荷斯坦公牛X精子凍后品質的冷凍稀釋液的配制方法，其特征在于，按下列步驟進行 1)準確稱取配方量的檸檬酸鈉、蔗糖、低密度脂蛋白、維生素E、維生素B12和甘油，加蒸餾水至100毫升，在磁力攪拌器上攪動60分鐘充分攪拌均勻，然后放入4°C冰箱過夜； 2)精液稀釋前加入壯觀霉素和慶大霉素并攪拌10分鐘，用酸或堿調整稀釋液的酸堿度，用PH計測定稀釋液的pH在6. 5 7. 5之間，然后用O. 22微米濾器對稀釋液進行慮菌處理，慮菌處理后放入37. 5°C水浴鍋中備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于提高荷斯坦公牛X精子凍后品質的冷凍稀釋液，該冷凍稀釋液每100毫升中含有以下物質檸檬酸鈉0.9～1.2克，蔗糖3～6克，低密度脂蛋白16-18毫克，甘油4～7毫升，維生素E500毫克～700毫克，維生素B12100毫克～200毫克，壯觀霉素0.35毫克，慶大霉素7～8萬單位(IU)，蒸餾水補足100毫升。實驗數(shù)據(jù)表明，該冷凍稀釋液提高了X精子凍融后的活力和精子頂體完整率，提高了精子凍后品質。
文檔編號A01N1/02GK102907417SQ20121040535
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月22日 優(yōu)先權日2012年10月22日
發(fā)明者趙憲林, 昝林森, 胡建宏, 田萬強, 王韋華, 郝瑞杰, 桂林生 申請人:西北農林科技大學