一個(gè)小麥非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：一個(gè)小麥非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開(kāi)了ー個(gè)小麥非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥赤霉病(FHB)是ー種真菌性病害，它能對(duì)小麥、大麥以及玉米等禾谷類(lèi)作物產(chǎn)生病害而直接造成作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降；另一方面，收獲的糧食由于被病原菌產(chǎn)生的deoxynivalenol (DON)和其他ー些單端孢霉烯類(lèi)毒素所污染,人和動(dòng)物食用后,均會(huì)危害健庚。目前隨著全球氣候的變暖，該病在全世界各個(gè)小麥種植區(qū)迅速蔓延，在我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)也日趨嚴(yán)重，控制小麥赤霉病的發(fā)生發(fā)展對(duì)于小麥安全生產(chǎn)意義重大。 小麥白粉病是小麥的第二大病害，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)抗白粉病基因位點(diǎn)，但由于小麥白粉病菌的專(zhuān)性寄生特性，小種專(zhuān)化抗性的抗病基因很容易喪失抗性，需要不斷發(fā)掘新的抗病基因資源，特別是具有廣譜抗性的基因資源。選育抗赤霉病小麥品種是控制赤霉病最經(jīng)濟(jì)和有效的途徑。明確其抗病機(jī)制，克隆抗病相關(guān)基因，對(duì)于防治小麥病害、開(kāi)展抗病育種改良具有重要理論指導(dǎo)意義。小麥抗病分子機(jī)制是目前小麥赤霉病研究的熱點(diǎn)課題。赤霉病病原菌與寄主小麥之間的互作關(guān)系十分復(fù)雜。赤霉病菌具有腐生兼寄生的特性，既能在死體植物上生活，也能從活體寄生植物上汲取營(yíng)養(yǎng)；小麥對(duì)赤霉病抗性是非小種專(zhuān)化的，同時(shí)也是多基因控制的數(shù)量遺傳性狀。分析病原菌-寄主互作過(guò)程中的基因表達(dá)情況，有助于發(fā)掘抗病基因和發(fā)現(xiàn)抗病通路，并進(jìn)ー步闡明抗病的分子機(jī)制。通過(guò)構(gòu)建受赤霉病菌誘導(dǎo)表達(dá)的cDNA文庫(kù)、SSH文庫(kù)，利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)、芯片技術(shù)等，篩選出了可能與赤霉病抗性相關(guān)的基因或蛋白，包括各種病程相關(guān)蛋白、細(xì)胞色素P450、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，也發(fā)現(xiàn)了茉莉酸途徑、乙烯途徑等信號(hào)通路與赤霉病抗性關(guān)。小麥地方品種望水白是到目前為止普遍公認(rèn)的赤霉病抗性強(qiáng)而且穩(wěn)定的小麥品種，在其染色體臂3BS上定位了ー個(gè)抗FHB的主效QTL。利用快中子輻射，獲得了一個(gè)望水白感赤霉病突變體NAUHl 17。本研究利用基因芯片技術(shù)，比較分析望水白及NAUHl 17受赤霉菌誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜，結(jié)合基因芯片雜交結(jié)果和電子定位信息，在望水白中克隆了ー個(gè)非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(TaLTP-B)，該基因定位于3BS抗FHB主效QTL區(qū)域，且位于突變體NAUHl17的缺失區(qū)段；利用基因槍技術(shù)將其轉(zhuǎn)化感赤霉病病小麥品種揚(yáng)麥158中，以期提高赤霉病抗性和白粉病抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供ー種非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B及其應(yīng)用。本發(fā)明的另ー目的是提供該基因的表達(dá)載體。
本發(fā)明的又一目的是提供該基因和表達(dá)載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B,來(lái)自普通小麥(Triticum asetivum L.)品種望水白，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I。該非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B編碼的蛋白質(zhì)TaLTP-B，其氨基酸序列為SEQID NO. 2。含有所述的非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B的表達(dá)載體。含有所述的非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B的表達(dá)載體優(yōu)選以pBI220為出發(fā)載體，將所述的TaLTP-B基因插入pBI220的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)間所得。所述的非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B在培育抗赤霉病和白粉病小麥品種中 的應(yīng)用。所述的非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B的表達(dá)載體在培育抗赤霉病和白粉病小麥品種中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明從小麥中克隆得到了ー個(gè)非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B及其所編碼的蛋白質(zhì)TaLTP-B。TaLTP-B可用于基因工程育種，將其插入表達(dá)載體pBI220，得到該基因的過(guò)量表達(dá)載體導(dǎo)入感病小麥品種中，可以提高感赤霉病和白粉病小麥品種對(duì)赤霉病和白粉病的抗性。


圖I利用普通小麥中國(guó)春第三部分同源群缺體-四體和部分3B短臂缺失系材料對(duì)TaLTP-B基因進(jìn)行染色體區(qū)段定位，將TaLTP-B定位到3BS的0. 78-0. 87區(qū)段I, Marker ;2，望水白(Wangshuibai) ；3, H117 ;4，中國(guó)春(Chinese Spring) ;5,中國(guó)春缺體-四體N3A/T3B ; 6，中國(guó)春缺體-四體N3B/T3D ; 7，中國(guó)春缺體-四體N3D/T3A ； 8，中國(guó)春缺失系3BS-1 ;9，中國(guó)春缺失系3BS-9 ;10，中國(guó)春缺失系3BS-8 ;11，中國(guó)春缺失系3BS-3 ;12，水(ddH20) 圖2TaLTP-B在望水白、NAUHl 17和感赤霉病小麥品種Alondra’ s受赤霉菌和DON誘導(dǎo)后的穗組織中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析X軸0h、12h、24h、48h、72h、96h分別表示小麥穗組織受赤霉菌誘導(dǎo)的不同時(shí)間段；Y_ =TaLTP-B基因在不同樣品中受赤霉菌誘導(dǎo)前后的表達(dá)倍數(shù)。圖3TaLTP_B過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建圖4TaLTP_B基因轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158的Ttl代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR分子鑒定結(jié)果泳道I為Marker，泳道2為未轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158對(duì)照，泳道3為包含目的基因的質(zhì)粒，泳道4為水空白對(duì)照，泳道5為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株H泳道6為Marker，泳道7_16依次為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株 T0-7、T0-13、T0-32、T0_51、T0_55、T0_58、T0_61、T0_65、T0_67、T0_68。圖5TaLTP_B基因轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158的Ttl代陽(yáng)性植株Q-RT-PCR分析結(jié)果X 軸T0-3、T0-7、T0-13、T0_32、T0_51、T0_55、T0_58、T0_61、T0_65、T0_67、T0_68 為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，T0-26為陰性轉(zhuǎn)化植株，揚(yáng)麥158為轉(zhuǎn)基因受體小麥；Y_ =TaLTP-B基因在轉(zhuǎn)基因植株中相對(duì)于揚(yáng)麥158的表達(dá)倍數(shù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I望水白受赤霉菌誘導(dǎo)的穗組織中ー個(gè)非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因克隆望水白(公知公用材料，裴自友，賈高峰等.普通小麥籽粒DON含量的配合力分析，作物學(xué)報(bào)，2007, 33(5) :731-737)是高抗赤霉病的材料。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中，利用快中子輻射望水白，篩選獲得感赤霉病突變體NAUHl 17 (公知公用材料，Jin Xiao，XinpingJia，et al. Afast-neutron induced fragment deletion oiin wheat varietyWangshuibai increased its susceptibility to Fusarium head blight. Chromosomeresearch, 2011，19:225-234)，該突變體發(fā)生了較復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)重排，導(dǎo)致定位于3BS上的抗赤霉病主效位點(diǎn)Fhbl缺失，因而感赤霉病性顯著提高。為了獲得望水白中與赤霉病抗病相關(guān)的基因，本研究利用小麥基因芯片篩選望水白和NAUH117赤霉菌接種前后的差異表達(dá)基因，從中選擇重要基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。在抽穗期對(duì)小穗采用單花滴注法接種赤霉菌，將赤霉菌分生孢子懸浮液濃度調(diào)·整為5，000個(gè)/ml，于中部小花注射IOiU孢子懸浮液，采用人工彌霧保濕方法溫室彌霧保濕3天，赤霉菌株是從田間自然發(fā)病植株上分離和培養(yǎng)得到(赤霉菌采集和培養(yǎng)方法見(jiàn)劉傳琴，關(guān)淑卿，黃巍.小麥赤霉菌分離培養(yǎng)及接種，現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，1998:9)，用不含赤霉菌的水接種作為陰性對(duì)照，共4個(gè)處理。接種后24h取穗樣，用TRIZOL (Invitrogen，CA，USA)按試劑說(shuō)明書(shū)分別提取總RNA，進(jìn)行基因芯片雜交(Affymetrix小麥基因表達(dá)譜芯片，part number 900515)，該實(shí)驗(yàn)在“上海國(guó)家生物芯片工程中心”完成。以實(shí)驗(yàn)組信號(hào)與對(duì)照組信號(hào)比值大于2為標(biāo)準(zhǔn)篩選上調(diào)表達(dá)基因。其中I個(gè)基因推測(cè)為非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白(nonspecifc lipid-transfer protein,探針號(hào)為 EST-432,增加倍數(shù)為 242倍)，在望水白中受赤霉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在NAUH117中不表達(dá)，挑選進(jìn)行候選基因克隆研究。根據(jù)探針 EST-432 序列設(shè)計(jì)引物，Pl (TCTGCCTGAGCTCACTACCA (SEQ ID 勵(lì).3))和卩2(ATATGTGGGTGTGCGTGTGT (SEQ ID NO. 4))，以望水白受赤霉菌誘導(dǎo)后24h的穗部組織cDNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)克隆望水白中該基因的cDNA全長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)望水白比NAUH117多擴(kuò)增出一個(gè)條帶，推測(cè)該條帶為染色體3BS的特異擴(kuò)增條帶，將該特異條帶回收并克隆到PMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，挑選含有目的片段的單克隆進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，獲得了大小為491bp的序列，序列如SEQ ID NO. I所示。通過(guò)NCBI網(wǎng)站中的ORF finder搜索該獲得序列的開(kāi)放閱讀框，發(fā)現(xiàn)其包含一個(gè)全長(zhǎng)ORF的基因，其中5’-UTR (非翻譯區(qū))43bp、3’-UTR100bp、0RF (開(kāi)放閱讀框)348bp，編碼115個(gè)氨基酸，序列如 SEQ ID NO. 2所不，利用 SignaIPChttp://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)分析了編碼蛋白，該蛋白N端具有26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，將該基因命名為T(mén)aLTP-B。實(shí)施例2TaLTP_B基因的染色體定位根據(jù)TaLTP-B 基因序列設(shè)計(jì)特異引物 P3(AGCGGCGTTAGGAGTCTAGC(SEQ ID NO. 5))和P4(TGCTCGATCAGCGAATCTTA(SEQ ID NO. 6)),以ー套普通小麥品種中國(guó)春的缺體-四體以及缺失系基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)TaLTP-B基因進(jìn)行染色體物理定位。PCR程序10-50ng/ul基因組模板，IOiiM的5，引物和3，引物各0. 4u I ；2. 5u I IOXbuffer ；
2U I 2. 5mM 的 dNTP ;2 U I 25mM 的 Mg2+;0. 2 U I (5U/U I) Taq polymerase(TaKaRa),加水至
反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 3min ；94°C 45s, 57°C 45s, 72°C lmin，33 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%的聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)。該引物只在第3部分同源群缺體-四體中出現(xiàn)擴(kuò)增帶型的差異，TaLTP-B在N3B/T3D和NAUH117中擴(kuò)增都缺少一條190bp的條帶，結(jié)果表明TaLTP-B位于3B染色體上，并且在NAUHl 17缺失。進(jìn)ー步在中國(guó)春3BS的缺失系(公知公用，Jin Xiao, Xinping Jia, et al. A Fast-neutron Induced Fragment Deletionof 3BS in wneat variety Wangshuibai Increased Its Susceptibility to FusariumHead Blight. Chromosome Research, 2011, 19:225-234.)中擴(kuò)增對(duì) TaLTP-B 進(jìn)行染色體區(qū)段定位，將該基因定位于3BS8FL0. 78-0. 87的染色體區(qū)段，即位于望水白3BS抗FHB主效QTL區(qū)域(圖I)。實(shí)施例3TaLTP_B基因受赤霉菌誘導(dǎo)的表達(dá)特征應(yīng)用能特異擴(kuò)增TaLTP-B 的特異引物 P3(AGCGGCGTTAGGAGTCTAGC(SEQ ID NO. 5))和P4 (TGCTCGATCAGCGAATCTTA (SEQ ID NO. 6))，對(duì)該基因受赤霉菌誘導(dǎo)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Q-RT-PCR)分析。PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(MylQ，Bio-Rad, USA)上擴(kuò)增并 檢測(cè)熒光。20uL PCR 反應(yīng)體系中含 2XSYBR Green PCR Master Mix 10uL，0. 4nmol/uL 弓丨物 Pl 和 P2，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2uL。擴(kuò)增參數(shù)為95°C lOmin，然后 95°C 15s、58°C 30s，72°C lmin,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線的測(cè)定。檢測(cè)基因表達(dá)水平定量用MyiQ系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在望水白中TaLTP-B受赤霉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，72h后表達(dá)水平達(dá)到峰值，之后開(kāi)始下調(diào)；在NAUH117中TaLTP-B缺失，因此在赤霉菌誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的各個(gè)時(shí)段都不能檢測(cè)其表達(dá)。在感赤霉病小麥品種Alondra’ s (公知公用，李明浩，陳煒，邢莉萍，等.普通小麥品種Alondra’s遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.植物學(xué)報(bào)，2010，45 (4) : 466-471)中，其表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間段也都低于在望水白中的表達(dá)量(圖2)。Q-RT-PCR的結(jié)果表明，TaLTP-B可能與赤霉病抗性相關(guān)。實(shí)施例4TaLTP_B正義表達(dá)載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化普通小麥揚(yáng)麥158以TaLTP-B基因cDNA為模板(制備方法見(jiàn)實(shí)施例1)，使用引物對(duì)P5(CGGGATCCATGGCCCGTTCTG (SEQ ID NO. 7))和 P6 (GGGGTACCTCAGCGAATCTTA (SEQ IDNO. 8))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段。用BamHI和KpnI雙酶切將擴(kuò)增目標(biāo)片斷插入到載體 pBI22。(Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. GUS fusions:beta-glucuronidaseas a sensitive and versatile gene fusion marker m higher pi&nts.EMBOJ. 1987，6:3901-3907.)的35s啟動(dòng)子后面的多克隆位點(diǎn)BamHI和KpnI之間。由此將目標(biāo)基因TaLTP-B克隆到強(qiáng)啟動(dòng)子35s的下游，獲得表達(dá)載體pBI220:TaLTP-B (圖3)。將構(gòu)建好的過(guò)量表達(dá)載體通過(guò)基因槍法轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158，挑選2800個(gè)幼胚愈傷進(jìn)行基因槍轟擊，轟擊前在高滲培養(yǎng)基(MS+ABA0. 5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2, 4_D2mg/L+葡萄糖30g/L+0. 4mol/L甘露醇，pH5. 8)上預(yù)處理4小時(shí)，轟擊后在高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)16小吋。之后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基(1/2MS (只有大量元素減半的MS)+水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5. 8)上暗培養(yǎng)2周，再將其轉(zhuǎn)移至含有除草劑的篩選培養(yǎng)基上(1/2MS+ABA0. 5mg/L+ 水解酪蛋白 500mg/L+2，4_D lmg/L+ 蔗糖 30g/L+4mg/L Bialaphos, pH5. 8)，篩選培養(yǎng)2周。然后將具有抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中(1/2MS+L-谷氨酞胺 lmmol/L+ 水解酪蛋白 200mg/L+KT lmg/L+1AA 0. 5mg/L+ 鹿糖 30g/L+瓊脂0. 8%, pH5. 8)進(jìn)行分化，待分化芽長(zhǎng)至2-4cm時(shí)將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2MS+KTlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0. 8%, pH5. 8)中。至再生苗長(zhǎng)約8cm、根系較健壯吋，即可開(kāi)管煉苗1-2天，最后洗去根系攜帯的培養(yǎng)基殘?jiān)憧梢圃匀肱枥?，獲得再生植株共70株。提取所有再生植株基因組DNA，對(duì)轉(zhuǎn)化植株利用載體上啟動(dòng)子引物P7(TGCGATAAAGGAAAGGCTATC (SEQ ID NO. 9))和基因內(nèi)部引物 P8 (TGCTCGATCAGCGAATCTTA(SEQID NO. 10))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以鑒定陽(yáng)性植株。PCR程序10_50ng/基因組模板，10 y M的 5’ 引物和 3’ 引物各 0. I ;2. I IOXbuffer ；2. 5u I 2. 5mM 的 dNTP ; I. 5 y I 25mM的 Mg2+;0.25ii I (5U/ u I) Taq polymerase (TaKaRa)，加水至 25 ii I。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 3min ；94°C 45s, 58°C 45s, 72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng) 8% 的聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)。其中11株可以擴(kuò)增約650bp的目的條帶，初歩鑒定為陽(yáng)性植株，株系編號(hào)依次為:T0-3、T0-7、T0-13、T0-32、T0_51、T0_55、T0_58、T0_61、T0_65、T0_67、T0_68 (圖4)。選取未接種赤霉菌的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，利用隨機(jī)挑選的陰性轉(zhuǎn)基因植株L-26以及轉(zhuǎn)基因受體揚(yáng)麥158作為陰性對(duì)照植株，提取穗部總RNA，利用TaLTP-B基因的特異引物 P3 (AGCGGCGTTAGGAGTCTAGC (SEQ ID 吣.5))和卩4 (TGCTCGATCAGCGAATCTTA (SEQ ID NO. 6))，進(jìn)行Q-RT-PCR分析。結(jié)果表明與對(duì)照揚(yáng)麥158相比，TQ-26植株中的TaLTP-B基因的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化！1^-46植株中的TaLTP-B基因的表達(dá)量只上調(diào)了約I. 6倍T0-5U T0-55 植株中的 TaLTP-B 基因的表達(dá)量上調(diào)約 2. 2-2. 4 倍；TQ-3、TQ-7、TQ-13、TQ-58、T0-6UT0-65,T0-67,T0-68植株中的TaLTP-B基因的表達(dá)量上調(diào)約3. 3-12. 6倍。其中，植株T0-67中該基因的表達(dá)量上調(diào)了約5. 3倍，植株L-61中該基因的表達(dá)量上調(diào)了約9. 2倍，植株L-7中該基因的表達(dá)量上調(diào)了約12. 6倍(圖5)。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因植株的赤霉病抗性鑒定對(duì)所有鑒定的陽(yáng)性植株、陰性植株L-26進(jìn)行赤霉病抗性鑒定(赤霉病抗性鑒定采用單花滴注方法將10 Ul孢子懸浮液5，000個(gè)/ml滴加到剛開(kāi)花穗子中部的ー朵小花，采用人工彌霧保濕方法溫室彌霧保濕3天，接種后21天后調(diào)查病小穗率。病小穗率=(發(fā)病小穗數(shù)/總小穗數(shù)X 100%),以未轉(zhuǎn)化感病小麥品種揚(yáng)麥158、抗病品種望水白為對(duì)照。轉(zhuǎn)基因 T0 代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株 T0-7,T0-13,T0-32,T0-51,T0-55,T0-58,T0-61,T0-65,T0-67,T0-68與轉(zhuǎn)基因受體揚(yáng)麥158相比，可以提聞對(duì)赤霉病的抗性。轉(zhuǎn)基因植株的病小穗率及t測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明1^-74-134-324-514-554-58,T0-6U T0-65, T0-67, T0-68植株與轉(zhuǎn)基因受體材料揚(yáng)麥158相比，接種小穗的平均病小穗率差異顯著！1^-26植株與揚(yáng)麥158相比，接種穗的平均病小穗率差異不顯著T0-13,Tq-32、Tq-51、Tq-55、Tq-58、Tq-61、Tq-67、T0-68植株與抗病對(duì)照望水白相比，接種小穗的平均病穗率差異不顯著；TQ-65、T0-26與望水白相比，接種小穗的平均病穗率差異顯著(表I)。表I轉(zhuǎn)基因植株的赤霉病抗性鑒定材料病小穗率{%)
均值±標(biāo)準(zhǔn) t測(cè)驗(yàn)值(揚(yáng)麥158}t測(cè)驗(yàn)值(望水白}統(tǒng)計(jì)穗數(shù)
揚(yáng)麥 15827.86±4.3716
望水白4.08±0.4216
To-79.52+3.812.44*I 598
Tn-1311.62+3.662.91*2.028
T0-2 630.76±4.240.343.68*7
T0-B 27.58±2.374.07*1.456
T0-Sl12.80±3.922.56*2.219
T0-5 57.65±2.243.95*1.339
Το-5810.91±4.172 801.6311
T0-Sl6.1211.844.58*1.086
T0-6510.89土2.373.41*2.82*8
T0-675.13+0.545.15*1.536
Το-684.22+0.475.37*0.217表I 中，Τ0-7、Τ0-13、Τ0-32、Τ0-51、Τ0-55、Τ0-58、Τ0-61、Τ0-65、Τ0-67、Τ0-68 為鑒定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，Τ0-26為鑒定陰性植株，揚(yáng)麥158為轉(zhuǎn)基因受體小麥品種，望水白為抗病對(duì)照。實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性鑒定用江蘇南京地區(qū)田間采集的白粉病菌混合菌種同時(shí)接種Ttl代轉(zhuǎn)基因植株、轉(zhuǎn)基因受體品種揚(yáng)麥158，進(jìn)行苗期離體和成株期白粉病抗性鑒定。抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)采用“0-9級(jí)”白粉病抗性反應(yīng)型的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0-2級(jí)為高抗、3-4級(jí)為中抗、5級(jí)以上為感病。苗期離體抗性鑒定的兩次重復(fù)結(jié)果表明揚(yáng)麥158和陰性轉(zhuǎn)基因植株1^-26表現(xiàn)為中感或高感；陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株中，Tq-3、T0-13和Tq-32均表現(xiàn)為高抗，T0-6UT0-67和TQ-68均表現(xiàn)為中抗，植株TciUtl-Si—次重復(fù)表現(xiàn)為高抗，另一次重復(fù)表現(xiàn)為中抗。成株期白粉病鑒定結(jié)果表明揚(yáng)麥158表現(xiàn)為中感或高感，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株中，H、T0-13, Τ0-32和Tci-Sl均表現(xiàn)為高抗，T0-7,T0-6UT0-67和1^-68均表現(xiàn)為中抗。除個(gè)別植株外，苗期離體和成株期白粉病抗性鑒定結(jié)果基本一致(表2)。表2轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性鑒定
權(quán)利要求
1.一個(gè)小麥非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.權(quán)利要求I所述非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因的蛋白質(zhì)TaLTP-B，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.含有權(quán)利要求I所述的非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B的表達(dá)載體是以PB 1220為出發(fā)載體，將權(quán)利要求I所述的TaLTP-B基因插入PBI220的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)間所得。
5.權(quán)利要求I所述的非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B在培育抗赤霉病和/或白粉病小麥品種中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3或4所述的含非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因TaLTP-B的表達(dá)載體在培育抗赤霉病和/或白粉病小麥品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)小麥非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。TaLTP-B的cDNA序列為SEQ ID NO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。該基因來(lái)自普通小麥(Triticum asetivum L.)品種望水白，在抗赤霉病小麥品種望水白中受赤霉菌誘導(dǎo)表達(dá)增強(qiáng)，且表達(dá)水平遠(yuǎn)高于感赤霉病小麥品種Alondra’s中的表達(dá)水平。將TaLTP-B基因轉(zhuǎn)化感赤霉病小麥品種揚(yáng)麥158，對(duì)轉(zhuǎn)基因T0代植株進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，結(jié)果表明TaLTP-B基因的過(guò)量表達(dá)可以提高揚(yáng)麥158對(duì)赤霉病的抗性。TaLTP-B基因可在培育抗赤霉病和白粉病小麥品種中應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102796748SQ20121029670
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月20日
發(fā)明者賈新平, 王秀娥, 肖進(jìn), 王海燕, 曹愛(ài)忠, 邢莉萍, 趙維萍, 李明浩, 陳煒, 金夏紅, 裴海巖 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)