專利名稱：一種長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物凈化領(lǐng)域，具體涉及一種長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法。
背景技術(shù)：
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物凈化是指在保留該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳性狀的前提下，提高該品種品系的微生物和寄生蟲質(zhì)量等級(jí)。按微生物學(xué)質(zhì)量控制的程度或根據(jù)微生物凈化程度分類，可分為五類(I)普通動(dòng)物(conventional animals):亦稱一級(jí)動(dòng)物,在微生物學(xué)控制上要求最低的動(dòng)物，它要求不攜帶人畜共患病和動(dòng)物烈性傳染病的病原。因價(jià)格低，故教學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用之。(2)清潔動(dòng)物(clean animals):亦稱二級(jí)動(dòng)物，除普通動(dòng)物應(yīng)排除的病原外，不 攜帶對(duì)動(dòng)物危害大和對(duì)科學(xué)研究干擾大的病原。(3)無特殊病原體動(dòng)物(specific-pathogen free animals):亦稱三級(jí)動(dòng)物，是指動(dòng)物體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在，但帶有非特定的微生物和寄生蟲的動(dòng)物。此類動(dòng)物應(yīng)排除一、二級(jí)動(dòng)物所排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對(duì)科研實(shí)驗(yàn)干擾大的病原。(4)無菌動(dòng)物(germ-free animals):是指在動(dòng)物體內(nèi)外的任何部位都檢不出一切生命體的動(dòng)物。這類動(dòng)物系在無菌條件下剖腹產(chǎn)出，又飼養(yǎng)在無菌、恒溫、恒濕的條件下，食品飲料等全部無菌。(5)悉生動(dòng)物(gnotobiotes animals):是指機(jī)體內(nèi)帶著已知微生物的動(dòng)物。此種動(dòng)物原是無菌動(dòng)物，系人為將指定微生物叢投給其體內(nèi)，例如使大腸桿菌定居在無菌小鼠體內(nèi)，在進(jìn)行微生物檢查時(shí)僅能檢出大腸桿菌。依據(jù)GB14922-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》劃分的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等級(jí)，并與寄生蟲學(xué)等級(jí)對(duì)應(yīng)，將實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠的微生物等級(jí)分為清潔級(jí)、無特定病原體級(jí)(SPF)和無菌級(jí)三個(gè)級(jí)別，普通級(jí)的實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠原則上不再使用；豚鼠、地鼠和兔分為普通級(jí)、清潔級(jí)、SPF級(jí)和無菌級(jí)四個(gè)級(jí)別。犬和猴分為普通級(jí)和SPF級(jí)二個(gè)級(jí)別。長(zhǎng)爪沙鼠(Mongoliangerbil,Meriones unguiculatus)亦稱長(zhǎng)爪沙土鼠，蒙古沙鼠或黑爪蒙古沙土鼠(內(nèi)蒙一帶)，黃耗子(河北壩上地區(qū))，砂耗子等。在動(dòng)物分類學(xué)上屬于哺乳綱，嚙齒目，倉鼠科，沙鼠亞科，沙鼠屬。分布在內(nèi)蒙古自治區(qū)及其毗鄰的省區(qū)，包括河北省北部、山西、陜西、甘當(dāng)、寧夏、青海等地的草原地帶。蒙古人民共和國(guó)和蘇聯(lián)布里亞特地區(qū)也有分布。長(zhǎng)爪沙鼠是一個(gè)正在被國(guó)內(nèi)外開發(fā)、有著廣闊應(yīng)用前景的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種，野生狀態(tài)的長(zhǎng)爪沙鼠世代生活在高海拔的干旱、半干旱的草原地帶，其生存環(huán)境的典型特點(diǎn)表現(xiàn)為食物貧乏、病原微生物較內(nèi)陸地區(qū)稀少等，由于特殊環(huán)境對(duì)該種群的長(zhǎng)期選擇，長(zhǎng)爪沙鼠在脂質(zhì)代謝、腎功能、免疫學(xué)等諸多方面的遺傳特性上與其他人工馴化的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在較大區(qū)別。因其具有獨(dú)特的生物學(xué)特征，長(zhǎng)爪沙鼠已被廣泛用于腦神經(jīng)、寄生蟲病、微生物、生殖、內(nèi)分泌、營(yíng)養(yǎng)、代謝及藥理、腫瘤等諸多領(lǐng)域研究，被稱為“多功能”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。我國(guó)現(xiàn)有的長(zhǎng)爪沙鼠為普通級(jí)種群，隨著生命科學(xué)的發(fā)展和社會(huì)公共安全意識(shí)的提高，科研試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量、微生物等級(jí)的要求也隨之升高，客觀上要求提供清潔級(jí)以上等級(jí)的長(zhǎng)爪沙鼠用于科學(xué)研究?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)尚無長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的研究報(bào)道，也無該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)孕鼠選擇和臨產(chǎn)期判斷、無菌剖腹產(chǎn)、長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的代乳、IVC飼養(yǎng)管理和微生物檢測(cè)技術(shù)等諸方面的操作技術(shù)的文字記載。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化 的方法，該方法可以將長(zhǎng)爪沙鼠的微生物和寄生蟲等級(jí)由普通級(jí)凈化為清潔級(jí)。一種長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，包括步驟(I)選取在無菌條件下剖腹產(chǎn)出的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠，以ICR泌乳小鼠作為長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠提供母乳或者人工授乳，在長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)開始增加含兔乳的小鼠飼料粉末，每IOOg小鼠飼料粉末中含兔乳60ml-70ml，直至長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠在25-30日齡體重達(dá)16g后安全離乳，得到離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠；(2)對(duì)步驟(I)中生產(chǎn)長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的長(zhǎng)爪沙鼠母鼠進(jìn)行支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物檢測(cè)；若長(zhǎng)爪沙鼠母鼠泰澤病原體抗體呈陽性，則檢測(cè)離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠泰澤病原體抗體，離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠抗體呈陽性者棄去，呈陰性者留用；若長(zhǎng)爪沙鼠母鼠支原體呈陽性，則棄去其生產(chǎn)的所有長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠；微生物檢測(cè)的主要原則為①長(zhǎng)爪沙鼠母鼠檢測(cè)結(jié)果呈陽性，則其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠全部檢測(cè)，呈陽性者棄去，呈陰性者留用長(zhǎng)爪沙鼠母鼠檢測(cè)結(jié)果可疑，則其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠抽樣檢測(cè)，抽樣比例為其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠總數(shù)的40%以上，呈陽性者棄去，呈陰性者留用長(zhǎng)爪沙鼠母鼠檢測(cè)結(jié)果呈陰性，則其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠不檢測(cè)，直接留用；(3)將步驟(2)中支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物檢測(cè)合格(呈陰性)的離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠放入屏障系統(tǒng)單獨(dú)飼養(yǎng)，并跟蹤檢測(cè)2代支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物，合格者(呈陰性)作為清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠。為了達(dá)到更好的發(fā)明效果，優(yōu)選所述的含兔乳的小鼠飼料粉末的添加次數(shù)為每天2-5次。每次以長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠吃飽為宜。在長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)開始增加含兔乳的小鼠飼料粉末，有助于剖腹產(chǎn)出的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠實(shí)現(xiàn)正常離乳，并于正常離乳前達(dá)到優(yōu)于自然分娩ICR小鼠代乳的體重水平。進(jìn)一步優(yōu)選，每IOOg小鼠飼料粉末中含兔乳67ml。所述的含兔乳的小鼠飼料粉末的制備方法，包括將小鼠飼料制成小鼠飼料粉末，添加滅菌后的兔乳，混合均勻，制得含兔乳的小鼠飼料粉末。所述的小鼠飼料具體可參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB14924. 2-2001)和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》(GB14924. 3-2010)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，可采用市售產(chǎn)品(如浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)基地生產(chǎn)的大、小鼠輻照繁殖料，質(zhì)量規(guī)格0 12mm顆粒)。所述的長(zhǎng)爪沙鼠母鼠在剖腹產(chǎn)前12-24小時(shí)肌肉注射2_4mg/次 只的劑量的黃體酮，每只總劑量不超過6mg，以延長(zhǎng)孕鼠分娩時(shí)間，方便綜合運(yùn)用觀察法、觸診法、黃體酮法等判定孕鼠分娩時(shí)間點(diǎn)，把握最佳剖腹產(chǎn)時(shí)機(jī)。在無菌條件下剖腹的條件包括應(yīng)用質(zhì)量百分濃度為2%的過氧乙酸水溶液作為消毒液，質(zhì)量百分濃度為5%的NaOH水溶液中和消毒液，以及紗布端斷臍和止血，環(huán)境溫度為30°C _33°C，提高無菌剖腹產(chǎn)手術(shù)成功率。所述的人工授乳，每日授乳量Y與大鼠體重X的關(guān)系為Y = 0. 361x-0. 167，Y的單位為mg，x的單位為g。授乳方法一般是每隔4h—次，每日6次，每次以喂飽為宜。人工授乳的乳液可采用母鼠乳液或者市售的與母鼠乳液營(yíng)養(yǎng)成分相近的人工乳。所述的ICR泌乳小鼠為產(chǎn)乳周期為20天以上且性情溫順的ICR泌乳小鼠。以ICR泌乳小鼠作為長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠提供母乳時(shí)，在ICR泌乳小鼠和長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠初次接觸時(shí)預(yù)留ICR泌乳小鼠親仔1-2只，同時(shí)將長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠放置在ICR泌乳小鼠籠內(nèi)，輕柔地將長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠與籠內(nèi)墊料充分混翻，確保長(zhǎng)爪沙鼠染味，混養(yǎng)數(shù)小時(shí) 后，若發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的腹部有乳白色乳液，表明授乳成功，此時(shí)將ICR泌乳小鼠親仔取出。選取產(chǎn)乳周期相對(duì)較長(zhǎng)，性情溫順的ICR泌乳小鼠作為長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠代乳鼠，在代乳鼠和仔鼠初次接觸時(shí)采用合理的染味、觀察等方法提高代乳成功率。優(yōu)選，于長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)按5g/天/只的量添加兔乳，直至安全離乳?？蛇M(jìn)一步助于剖腹產(chǎn)出的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠實(shí)現(xiàn)正常離乳，并于正常離乳前達(dá)到優(yōu)于自然分娩ICR小鼠代乳的體重水平。所述的兔乳為泌乳母兔分泌的新鮮乳汁，即兔乳原液；可人工采集泌乳母兔新鮮乳汁，于_20°C保存待用。臨用前，取出乳汁后，經(jīng)高壓蒸汽(115°C，15min)滅菌備用。所述的其他垂直感染微生物包括弓形蟲、小鼠肝炎病毒、流行性出血熱病毒等，主要包括弓形蟲、小鼠肝炎病毒和流行性出血熱病毒。因長(zhǎng)爪沙鼠好動(dòng)，為保持內(nèi)環(huán)境清潔，安全離乳前(即整個(gè)代乳或授乳過程)最好每3天更換一次墊料。長(zhǎng)爪沙鼠生性好動(dòng)，墊料消耗大，且容易變臟。在高壓滅菌草紙、木屑等材料中選擇合適的墊料及更換周期，理想的溫濕度控制等，是長(zhǎng)爪沙鼠IVC飼養(yǎng)管理的重要工作。由于待凈化的孕鼠自然分娩存在病原微生物對(duì)仔鼠的污染，因此，為實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物凈化目標(biāo)，需采用無菌剖腹產(chǎn)的仔鼠，并需建立代乳技術(shù)和微生物監(jiān)測(cè)?，F(xiàn)有長(zhǎng)爪沙鼠為普通級(jí)種群，不適合作為無菌剖腹產(chǎn)的仔鼠的代乳鼠。本發(fā)明選擇合適的其他品種品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物=ICR泌乳小鼠作為代乳鼠，確保仔鼠乳量充足、貫穿整個(gè)哺乳期直到離乳，是本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)。微生物檢測(cè)結(jié)果是長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化成功與否的衡量標(biāo)準(zhǔn)，因此，本發(fā)明在實(shí)施生物凈化前對(duì)普通級(jí)和生物凈化的長(zhǎng)爪沙鼠種群進(jìn)行全面的微生物普查，并在生物凈化過程中不斷對(duì)親代長(zhǎng)爪沙鼠和生物凈化后長(zhǎng)爪沙鼠進(jìn)行微生物監(jiān)測(cè)。普查主要針對(duì)存在垂直傳播風(fēng)險(xiǎn)的泰澤病原體和支原體，選擇合適的監(jiān)測(cè)方案直接關(guān)系生物凈化的成敗。
圖I為分別以長(zhǎng)爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳的自然分娩仔代長(zhǎng)爪沙鼠(仔長(zhǎng)爪沙鼠)每窩存活率趨勢(shì)圖；圖2為分別以長(zhǎng)爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳的自然分娩仔代長(zhǎng)爪沙鼠(仔長(zhǎng)爪沙鼠)生長(zhǎng)曲線比較；圖3為本發(fā)明生物凈化代乳仔代長(zhǎng)爪沙鼠與自然分娩母乳喂養(yǎng)長(zhǎng)爪沙鼠的生長(zhǎng)曲線比較；圖4為剖腹產(chǎn)長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠由ICR泌乳小鼠代乳并配合輔料飼養(yǎng)與剖腹產(chǎn)長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠由ICR小鼠代乳至斷奶、自然分娩長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠由ICR小鼠代乳和由親母鼠代乳的生長(zhǎng)曲線比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I長(zhǎng)爪沙鼠孕鼠選擇和臨產(chǎn)期判斷、無菌剖腹產(chǎn)、長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的代乳、IVC飼養(yǎng)管理和微生物檢測(cè)技術(shù)等諸方面的關(guān)鍵技術(shù)。
I.孕鼠選擇和臨產(chǎn)期判斷長(zhǎng)爪沙鼠與大鼠、小鼠不同，長(zhǎng)爪沙鼠是“一夫一妻”長(zhǎng)期同居的繁殖方式，因此選擇普通級(jí)3月齡的長(zhǎng)爪沙鼠雌雄比I : I進(jìn)行同居交配。小鼠的妊娠期為19-21天，長(zhǎng)爪沙鼠妊娠期24-26天，因此代乳ICR小鼠的交配一般較剖腹產(chǎn)母鼠交配時(shí)間遲3-4天，即ICR代乳母鼠在剖腹產(chǎn)手術(shù)前12-36小時(shí)內(nèi)分娩。長(zhǎng)爪沙鼠交配后不容易見到明顯的陰道栓，很難通過查找陰道栓的方法推算長(zhǎng)爪沙鼠的預(yù)產(chǎn)期。此外，嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在接近出生前的24h內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育最旺盛，仔鼠初生時(shí)20%體重都是在最后24h內(nèi)生長(zhǎng)的，提早幾個(gè)小時(shí)或者十幾小時(shí)進(jìn)行剖腹產(chǎn)都會(huì)對(duì)胎兒的成熟造成很大影響，因此通過計(jì)算長(zhǎng)爪沙鼠雌雄同居時(shí)間，綜合運(yùn)用觀察法、觸診法、黃體酮法等多種方法來判斷確定孕長(zhǎng)爪沙鼠分娩時(shí)間點(diǎn)，把握最佳剖腹產(chǎn)時(shí)機(jī)。通過①觀察法觀察分娩前孕鼠躁動(dòng)不安、清理產(chǎn)床，孕長(zhǎng)爪沙鼠下腹部膨大、外陰濕潤(rùn)鮮紅且陰道口擴(kuò)大，待孕鼠俯臥巢內(nèi)并見流血和羊水后即表明將分娩。②觸診法安靜自然保定分娩期(妊娠后期)孕長(zhǎng)爪沙鼠，通過觸摸其腹部，對(duì)比感覺腹肌松弛度，胎仔頭硬度，胎仔頭和軀干大小，當(dāng)胎仔頭和軀干大小一致(寬度達(dá)到約0.8-1. 2cm)，腹肌松弛，胎仔頭硬度較大時(shí)，則可判斷為孕長(zhǎng)爪沙鼠分娩時(shí)機(jī)成熟。③黃體酮法長(zhǎng)爪沙鼠分娩通常發(fā)生在夜間，為適當(dāng)順延分娩時(shí)間，提高剖腹產(chǎn)手術(shù)的成功率，需預(yù)先給孕長(zhǎng)爪沙鼠肌肉注射黃體酮。一般對(duì)預(yù)計(jì)2小時(shí)內(nèi)或夜間產(chǎn)仔的孕長(zhǎng)爪沙鼠肌肉注射2-4mg/(次 只)劑量的黃體酮，動(dòng)物可于注射后12-24小時(shí)內(nèi)施行剖腹產(chǎn)手術(shù)。須注意給藥總劑量不宜過多(總劑量不超過6mg，次數(shù)不超過3次)，否則易導(dǎo)致剖腹產(chǎn)胎仔鼠發(fā)黑、過于成熟，甚至出現(xiàn)死胎現(xiàn)象。2.剖腹產(chǎn)手術(shù)整個(gè)手術(shù)過程應(yīng)無菌操作。用約35°C的蒸餾水配制質(zhì)量百分濃度為2%過氧乙酸消毒液。采用頸椎脫白法處死孕鼠后，迅速將其浸入消毒液5s，置于手術(shù)臺(tái)，固定四肢。消毒大鼠腹部，用滅菌剪、鑷開腹腔，暴露子宮。用止血鉗夾住兩側(cè)輸卵管前側(cè)和子宮遠(yuǎn)端，從遠(yuǎn)端切斷子宮，此過程操作應(yīng)迅速，約需45-60S。切取子宮后，將其連同止血鉗迅速放入35°C滅菌消毒液中浸泡約10s。立即以質(zhì)量百分濃度5% NaOH堿液(溶劑為水)中和消毒液，并用滅菌蒸餾水沖洗，以紗布吸附剩余液體。滅菌鑷子迅速撕開子宮，破羊膜取出胎仔，用紗布或棉簽去除羊水，擦凈胎盤和胎仔，特別是胎仔的口鼻處。以濕棉簽輕輕按摩胎仔胸部，刺激其獲得自主呼吸，全過程需密切注意保溫。至胎仔全身呈鮮紅色，扭曲臍帶，并用無菌紗布扯斷臍帶并壓迫止血。自主呼吸的仔鼠體色由紫紅色逐漸轉(zhuǎn)成鮮紅色，約半小時(shí)后可開始授乳或接受代乳。留取部分胎盤和子宮放入試管，取出隔離器后進(jìn)行微生物檢測(cè)。新生幼仔的剖腹取胎時(shí)手術(shù)臺(tái)環(huán)境溫度一般控制在30_33°C，與代乳鼠合攏后降至 20-26 °C，濕度 40-70%。3.雌鼠代乳技術(shù)選取經(jīng)產(chǎn)、母性較好的ICR雌鼠為剖腹產(chǎn)長(zhǎng)爪沙鼠的代乳母鼠。在已確定乳母鼠懷孕的情況下，應(yīng)將雄鼠移出，以免生產(chǎn)后又懷孕，影響帶乳。將生產(chǎn)前2-3天的ICR小鼠轉(zhuǎn)移到凈化室，以適應(yīng)環(huán)境。ICR小鼠在生產(chǎn)前三天停止更換墊料。選取產(chǎn)乳周期為20天以上且性情溫順的ICR泌乳小鼠作為長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠，在完成剖腹產(chǎn)術(shù)后，ICR泌乳小鼠的親仔留下1-2只，同時(shí)將剛剖腹產(chǎn)出來的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠(仔長(zhǎng)爪沙鼠)放置在乳母鼠籠內(nèi)，輕柔地將其與籠內(nèi)墊料充分混翻，確保長(zhǎng)爪沙鼠染味，該程序?qū)θ槟甘蟮氖谌橹陵P(guān)重要。混養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，若發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的腹部有乳白色乳液，表明授乳成功，此時(shí)應(yīng) 將ICR泌乳小鼠親仔取出。由于長(zhǎng)爪沙鼠和ICR小鼠在離乳期上的差別，代乳長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠從17日齡開始體重增加會(huì)出現(xiàn)明顯停滯，提示營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，因此在17-20日齡時(shí)開始增加軟料，即含67%(v/w,ml兔乳/IOOg小鼠飼料粉末)兔乳的小鼠飼料粉末，每天至少添加兩次，每次以長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠吃飽為宜。軟料(即含兔乳的小鼠飼料粉末)的制備將小鼠飼料(浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)基地生產(chǎn)的大、小鼠輻照繁殖料，質(zhì)量規(guī)格0 12mm顆粒)粉碎成粉末，置無菌瓶皿中，添加高壓滅菌后的兔乳，將飼料粉末充分?jǐn)嚢杌靹蛑吝m當(dāng)濕度即可，每次添加兔乳不可太多。同時(shí)在長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)按5g/天/只的量添加兔乳，直至安全離乳。代乳期間每3天更換一次墊料。代乳仔長(zhǎng)爪沙鼠在25-30日齡間，體重達(dá)16g可安全離乳，得到離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠。4.微生物檢測(cè)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)爪沙鼠易感病原體中存在垂直感染導(dǎo)致生物凈化失敗風(fēng)險(xiǎn)的主要為支原體和泰澤病原體。孕長(zhǎng)爪沙鼠在實(shí)施剖腹產(chǎn)手術(shù)前摘眼球采血檢測(cè)泰澤病原體抗體，剖腹產(chǎn)手術(shù)后迅速實(shí)施無菌取氣管，經(jīng)研磨過0. 45 y m濾膜，進(jìn)行支原體培養(yǎng)。泰澤病原體抗體檢測(cè)及支原體培養(yǎng)具體操作依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量控制的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物泰澤病原體檢測(cè)方法GB/T 14926. 10-2008,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物支原體檢測(cè)方法GB/T14926.8-2001)。根據(jù)母鼠抗體檢測(cè)與支原體培養(yǎng)情況分別進(jìn)行處理。若母鼠泰澤病原體抗體陽性，則在仔鼠斷奶后進(jìn)行眼靜脈竇采血，再次測(cè)抗體，抗體陽性者棄去或迅速處死，以防止接觸傳播病原體。若母鼠支原體陽性，則棄去整窩仔鼠。微生物檢測(cè)的主要原則為①長(zhǎng)爪沙鼠母鼠檢測(cè)結(jié)果呈陽性，則其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠全部檢測(cè)，呈陽性者棄去，呈陰性者留用長(zhǎng)爪沙鼠母鼠檢測(cè)結(jié)果可疑，則其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠抽樣檢測(cè)，抽樣比例為其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠總數(shù)的40%以上，呈陽性者棄去，呈陰性者留用長(zhǎng)爪沙鼠母鼠檢測(cè)結(jié)果呈陰性，則其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠不檢測(cè)，直接留用。將支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物檢測(cè)合格的離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠放入屏障系統(tǒng)單獨(dú)飼養(yǎng)，并跟蹤檢測(cè)2代支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物，合格者作為清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠。微生物跟蹤檢測(cè)主要針對(duì)易造成垂直感染病原體，主要包括泰澤氏病原體、支原體、弓形蟲、小鼠肝炎病毒、流行性出血熱病毒(檢測(cè)方法分別依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)方法GB/T 18448. 2-2008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠肝炎病毒檢測(cè)方法GB/T 14926. 22-2001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物漢坦病毒檢測(cè)方法GB/T 14926. 19-2001)等。 長(zhǎng)爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳比較仔長(zhǎng)爪沙鼠經(jīng)長(zhǎng)爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳后的存活率見圖I。由圖可知，SD大鼠代乳的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠在3日齡開始出現(xiàn)顯著性死亡，存活率降至80%以下，到11日齡，仔鼠存活率降至47%，在17日齡更有2窩仔鼠整體淘汰；仔鼠25日齡時(shí)，存活率僅為31% ;在整個(gè)代乳期，仔鼠均存在陸續(xù)死亡現(xiàn)象。ICR小鼠代乳的48只仔鼠中，有46只存活，25日齡時(shí)存活率為95%。長(zhǎng)爪沙鼠代乳的仔鼠中，僅一組動(dòng)物出現(xiàn)3只死亡，其余45 只均存活。通過比較各組仔鼠平均體重(見圖2)，發(fā)現(xiàn)ICR小鼠代乳的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠在20日齡前平均體重均略高于長(zhǎng)爪沙鼠代乳和SD大鼠代乳的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠，個(gè)別日齡存在顯著性差異，表明ICR小鼠代乳的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況較為理想。在20日齡后，與長(zhǎng)爪沙鼠代乳的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠比較，ICR小鼠代乳長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠體重增重明顯變緩，這可能與ICR小鼠哺乳周期有關(guān)。此外，SD大鼠代乳長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的體重變化存在較為明顯的組內(nèi)波動(dòng)。綜合上述結(jié)果，選擇ICR小鼠作為長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化后的代乳鼠。 剖腹產(chǎn)及代乳情況采用未添加軟料組的生物凈化方法，共實(shí)施長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化臨產(chǎn)期判斷150多胎次，無菌剖腹產(chǎn)達(dá)85胎次，通過ICR代乳鼠代乳并成功斷乳167只，平均胎仔出生體重
2.9g/只，窩平均胎子數(shù)8. 4只/窩，共完成20只生物凈化代乳長(zhǎng)爪沙鼠和正常長(zhǎng)爪沙鼠生長(zhǎng)曲線比較(圖3)。與母乳喂養(yǎng)的普通級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠相比，未添加軟料組的生物凈化后的代乳長(zhǎng)爪沙鼠體重普遍較低，從I日齡到25日齡均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由圖4可知，與自然分娩仔鼠的ICR小鼠代乳組相比，剖腹產(chǎn)仔長(zhǎng)爪沙鼠的生長(zhǎng)曲線普遍較低，提示剖腹產(chǎn)手術(shù)對(duì)仔長(zhǎng)爪沙鼠的生長(zhǎng)發(fā)育帶來較大影響，本發(fā)明添加軟料組可顯著提高17日齡后剖腹產(chǎn)仔長(zhǎng)爪沙鼠的體重增長(zhǎng)速度，并于斷奶前達(dá)到優(yōu)于自然分娩ICR小鼠代乳組的體重水平，表明所添軟料有助于剖腹產(chǎn)手術(shù)中的仔長(zhǎng)爪沙鼠實(shí)現(xiàn)正常離乳。此外，人工授乳方式可替代以ICR泌乳小鼠為長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠來實(shí)現(xiàn)生物凈化后仔鼠的代乳，該技術(shù)的操作方法為(以大鼠人工授乳為例說明)新生動(dòng)物(長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠)經(jīng)人工授乳需要非常熟練的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括強(qiáng)飼、吸吮二種人工授乳方法。強(qiáng)飼法可保證每次灌喂人工乳的量，而吸吮法模擬自然吸吮的方式，但控制不了每次的哺乳量。授乳方法是每隔4h—次，每日6次。每日授乳量Y(mg)與大鼠體重x(g)的關(guān)系參照一次方程Y = 0. 361x-0. 167。對(duì)于授乳時(shí)下腹部脹滿的動(dòng)物，要用脫脂棉壓迫刺激其下腹部，促其排尿；還要用浸水后擰干的脫脂棉刺激肛門，使其排糞。最為理想的人工乳是采集哺乳期8 21天的母鼠乳，或處死哺乳期幼鼠，從胃中取乳，但由于采集困難，很少采用。目前，國(guó)內(nèi)外主要采用配制與母鼠乳營(yíng)養(yǎng)成分相近的人工乳，人工乳可采用市售無菌大鼠王氏(1991年)人工乳的配方(見表I)。乳鼠隨著其自身的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求也在不斷變化，因而，隨著乳鼠的生長(zhǎng)有針對(duì)性地設(shè)計(jì)不同配方的人工乳，有利于不同日齡動(dòng)物獲得生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，包括步驟 (1)選取在無菌條件下剖腹產(chǎn)出的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠，以ICR泌乳小鼠作為長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠提供母乳或者人工授乳，在長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)開始增加含兔乳的小鼠飼料粉末，每IOOg小鼠飼料粉末中含兔乳60ml-70ml，直至長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠在25-30日齡體重達(dá)16g后安全離乳，得到離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠； (2)對(duì)步驟(I)中生產(chǎn)長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的長(zhǎng)爪沙鼠母鼠進(jìn)行支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物檢測(cè)；若長(zhǎng)爪沙鼠母鼠泰澤病原體抗體呈陽性，則檢測(cè)離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠泰澤病原體抗體，離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠抗體呈陽性者棄去，呈陰性者留用；若長(zhǎng)爪沙鼠母鼠支原體呈陽性，則棄去其生產(chǎn)的所有長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠；微生物檢測(cè)的主要原則為①長(zhǎng)爪沙鼠母鼠檢測(cè)結(jié)果呈陽性，則其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠全部檢測(cè)，呈陽性者棄去，呈陰性者留用長(zhǎng)爪沙鼠母鼠檢測(cè)結(jié)果可疑，則其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠抽樣檢測(cè)，抽樣比例為其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠總數(shù)的40%以上，呈陽性者棄去，呈陰性者留用；③長(zhǎng)爪沙鼠母鼠檢測(cè)結(jié)果呈陰性，則其生產(chǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠不檢測(cè)，直接留用； (3)將步驟(2)中支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物檢測(cè)合格的離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠放入屏障系統(tǒng)單獨(dú)飼養(yǎng)，并跟蹤檢測(cè)2代支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物，合格者作為清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，所述的含兔乳的小鼠飼料粉末的添加次數(shù)為每天2-5次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，每IOOg小鼠飼料粉末中含兔乳67ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，所述的含兔乳的小鼠飼料粉末的制備方法，包括將小鼠飼料粉碎成小鼠飼料粉末，添加滅菌后的兔乳，混合均勻，制得含兔乳的小鼠飼料粉末。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，長(zhǎng)爪沙鼠母鼠在剖腹產(chǎn)前12-24小時(shí)肌肉注射2-4mg/次·只的劑量的黃體酮，每只總劑量不超過6mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，所述的人工授乳，每日授乳量Y與大鼠體重X的關(guān)系為Y = O. 361χ-0. 167，Y的單位為mg，x的單位為g。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，所述的ICR泌乳小鼠為產(chǎn)乳周期為20天以上且性情溫順的ICR泌乳小鼠。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，以ICR泌乳小鼠作為長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠提供母乳時(shí)，在ICR泌乳小鼠和長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠初次接觸時(shí)預(yù)留ICR泌乳小鼠親仔1-2只，同時(shí)將長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠放置在ICR泌乳小鼠籠內(nèi)，輕柔地將長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠與籠內(nèi)墊料充分混翻，確保長(zhǎng)爪沙鼠染味，混養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，若發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的腹部有乳白色乳液，表明授乳成功，此時(shí)將ICR泌乳小鼠親仔取出。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，步驟(I)中，安全離乳前每3天更換一次墊料。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，于長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)按5g/天/只的量添加兔乳，直至安全離乳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長(zhǎng)爪沙鼠生物凈化的方法，包括選取在無菌條件下剖腹產(chǎn)出的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠，以ICR泌乳小鼠作為長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠給長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠提供母乳或者人工授乳，在長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)開始增加含兔乳的小鼠飼料粉末，每100g小鼠飼料粉末中含兔乳60ml-70ml，直至長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠在25-30日齡體重達(dá)16g后安全離乳，得到離乳后的長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠；對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠母鼠和仔鼠進(jìn)行支原體和泰澤病原體等微生物檢測(cè)，合格的離乳后的仔鼠放入屏障系統(tǒng)單獨(dú)飼養(yǎng)，并跟蹤檢測(cè)2代支原體和泰澤病原體等微生物，合格者作為清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠。該方法實(shí)現(xiàn)了將長(zhǎng)爪沙鼠的微生物等級(jí)由普通級(jí)凈化為清潔級(jí)。
文檔編號(hào)A01K67/02GK102812920SQ201210288188
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月14日
發(fā)明者戴方偉, 盧領(lǐng)群, 宋曉明, 周莎桑, 薩曉嬰, 李長(zhǎng)龍, 馬偉鋒, 柯賢福, 樓琦 申請(qǐng)人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院