專利名稱：一種利用山藥帶腋芽莖段組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明“一種利用山藥帶腋芽莖段組織培養(yǎng)的方法”，是由山藥帶腋芽莖段外植體經(jīng)組織培養(yǎng)獲得試管苗，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
山藥(Dioscorea Opposita Thunb.),為薯菌科薯菌屬多年生草質(zhì)纏繞性藤本植物，我國南北各地均有種植。因其具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，是我國地道的藥材和傳 統(tǒng)出口商品，其產(chǎn)品暢銷東南亞和日本等國。由于長期進行營養(yǎng)繁殖，不僅用種量大、擴繁速度慢，還因連續(xù)種植使病毒不斷積累導(dǎo)致種性退化，使其種植面積逐年下降，嚴重影響了質(zhì)量和產(chǎn)量的提高。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立山藥離體再生體系，不僅可以加快山藥種苗繁殖速度，提高其繁殖效率，而且可顯著改善其品質(zhì)，提高其產(chǎn)量。山藥組織培養(yǎng)的研究國內(nèi)外均有報道，但多以莖段、零余子等誘導(dǎo)愈傷組織為研究內(nèi)容，不利于保持品種的穩(wěn)定性。離體條件下利用山藥帶腋芽莖段誘導(dǎo)獲得試管苗，可明顯提高繁殖系數(shù)和繁殖速度。它不僅具有繁殖率高和利于誘導(dǎo)形成零余子(另申請專利)的特點，而且利于保持本品種的優(yōu)良特性。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是找到既能提高山藥種薯繁殖系數(shù)和繁殖速度，又能保持品種穩(wěn)定性的方法，此方法具有繁殖系數(shù)高、繁殖速度快、繁殖效率高，種苗病毒少、遺傳穩(wěn)定性好且不受環(huán)境條件的影響等優(yōu)點，可以彌補現(xiàn)有山藥薯塊繁殖系數(shù)低、愈傷組織誘導(dǎo)組培苗繁瑣、時間長、效率低的不足，從而為山藥種薯擴繁提供一種新的方法。技術(shù)方案
一種利用山藥帶腋芽莖段組織培養(yǎng)的方法，包括以下步驟
(I)材料處理將山藥的塊莖淺埋在細沙中，栽培在恒溫(25 °C )培養(yǎng)室中，長出幼苗時待用。(2)外植體的滅菌取鐵棍山藥的嫩莖，去掉葉片，用剪刀截成2-3cm帶腋芽的莖段，流動水沖洗IOmin左右。在超凈臺上用75%酒精浸泡30s，用NaClO滅菌20min，無菌水漂洗5-7次，用解剖刀切去末端留下約I. 5-2cm左右的莖段接種在MS培養(yǎng)基中。(3)芽的誘導(dǎo)分化外植體經(jīng)滅菌后接種6-BAO. 5_lmg r1，NAAO-O. Img濃度的MS
培養(yǎng)基中。(4)繼代增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)出的不定芽長到帶兩片和兩片以上葉片的時候，切取單芽接種在6-BA I. 5mg 1_\ NAA Omg F1濃度的MS培養(yǎng)基中。(5)生根培養(yǎng)將高2.0 cm以上、帶有2片或兩片以上葉的健壯小苗切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基成分為6-BA1. Omg F1, MAO. 2mg I'活性炭0. 02%濃度的MS培養(yǎng)基中。
(6)培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為25±2°C，光照強度1200-15001x，每天光照12h/d。培養(yǎng)基中瓊脂的質(zhì)量分數(shù)為7g/L，蔗糖的質(zhì)量分數(shù)為30g/L。有益效果
本發(fā)明能夠由帶腋芽莖段外植體誘導(dǎo)獲得山藥組培苗，從而可以室內(nèi)大量繁殖試管苗，實現(xiàn)山藥種薯繁殖工廠化生產(chǎn)。此方法包括幾個階段培養(yǎng)基成分以及處理方法，僅20天左右就可以獲得完整組培苗。本發(fā)明具有繁殖系數(shù)高、繁殖速度快、繁殖效率高，種苗病毒少、遺傳穩(wěn)定性好且不受環(huán)境條件的影響的特點。日本白、無架山藥等品種，利用帶腋芽莖段按本發(fā)明進行組織培養(yǎng)，均可得到完整組培苗。其中日本白的增殖倍數(shù)為2. 5，無架山藥為1.5。
圖I帶腋芽莖段。圖2叢生芽。圖3繼代培養(yǎng) 圖4生根培養(yǎng)。圖5組培苗。
具體實施例方式下面通過基于帶腋芽莖段外植體誘導(dǎo)獲得山藥組培苗實施例進一步說明本發(fā)明。I材料處理
將來源于河南溫縣的鐵棍山藥的塊莖淺埋在細沙中，栽培在恒溫(25 °C )培養(yǎng)室中，長出幼苗時待用。2培養(yǎng)基滅菌及培養(yǎng)條件
高壓滅菌前調(diào)整培養(yǎng)基pH值為5. 8，保持121°C滅菌20min。培養(yǎng)室溫度為25±2°C，光照強度1200-15001X，每天光照12h。培養(yǎng)基中瓊脂的質(zhì)量分數(shù)為7g/L，蔗糖的質(zhì)量分數(shù)為 30g/L。3外植體的滅菌試驗
3.I試驗設(shè)計
取鐵棍山藥的嫩莖，去掉葉片，用剪刀截成2-3cm帶腋芽的莖段，流動水沖洗IOmin左右。在超凈臺上用75%酒精浸泡30s，用NaClO分別滅菌15min、20 min、30 min，無菌水漂洗5-7次，用解剖刀切去末端留下約I. 5-2cm左右的莖段接種在MS培養(yǎng)基中，觀察殺菌效果。3. 2不同滅菌時間對外植體滅菌效果的影響
從表I可以看出，外植體滅菌20min效果較好，滅菌成功率達85. 2%，死亡率僅為3. 7%。由此可見，在NaClO濃度相同的情況下，外植體的滅菌時間應(yīng)該控制在20min左右，時間太長會增加死亡棵數(shù)，時間太短則會使污染數(shù)增加，影響滅菌成功率。
表I不同滅菌時間對外植體滅菌效果的影響
權(quán)利要求
1.一種利用山藥帶腋芽莖段組織培養(yǎng)方法，包括外植體的滅菌、芽的誘導(dǎo)分化和繼代增殖、生根培養(yǎng)，其特征在于 (1)外植體的滅菌取鐵棍山藥的嫩莖，去掉葉片，用剪刀截成2-3cm帶腋芽的莖段，流動水沖洗IOmin ;在超凈臺上用75%酒精浸泡30s，用NaClO滅菌20min，無菌水漂洗5-7次，切去末端留下I. 5-2cm的帶腋芽莖段接種在MS培養(yǎng)基中； (2)芽的誘導(dǎo)分化外植體經(jīng)滅菌后接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)為含0.5-lmg F16-BA, 0-0. Img F1 NAA 的 MS 培養(yǎng)基； (3)繼代增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)出的不定芽長到帶兩片或兩片以上葉片的時候，切取單芽接種在繼代增殖培養(yǎng)基中，繼代增殖培養(yǎng)基為含I. 5mg F1 6-BA,0mg F1 NAA的MS培養(yǎng)基; (4)生根培養(yǎng)將高2.0cm以上、帶有2片葉的健壯小苗切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基成分為含I. Omg F1 6-BA，0. 2mg F1 NAA，質(zhì)量比為0. 02%的活性炭的MS培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種利用山藥帶腋芽莖段組織培養(yǎng)方法，其特征在于其所述步驟(2) (4)的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)室溫度為25±2°C，光照強度1200-15001x，每天光照12h，培養(yǎng)基中瓊脂的質(zhì)量分數(shù)為7g/L，蔗糖的質(zhì)量分數(shù)為30g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了“一種利用山藥帶腋芽莖段組織培養(yǎng)方法”。選取山藥帶腋芽莖段作為外植體，經(jīng)過芽的誘導(dǎo)、繼代增殖、生根培養(yǎng)等一系列操作步驟，最后形成山藥試管苗。此方法包括幾個階段培養(yǎng)基成分以及處理方法，僅20天左右就可以獲得完整組培苗。本發(fā)明能夠由帶腋芽莖段外植體誘導(dǎo)獲得山藥組培苗，從而可以室內(nèi)大量繁殖試管苗，實現(xiàn)山藥種薯繁殖工廠化生產(chǎn)。本發(fā)明具有繁殖系數(shù)高、繁殖速度快、繁殖效率高，種苗病毒少、遺傳穩(wěn)定性好且不受環(huán)境條件的影響的特點。
文檔編號A01H4/00GK102657092SQ201210158588
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月22日
發(fā)明者張培通, 張恒友, 彭琦, 殷劍美, 郭文琦, 韓曉勇 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院