專利名稱：一種對蝦抗病毒能力測試的定量、大規(guī)模感染方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于對蝦抗病良種選育領(lǐng)域，具體地涉及一種對蝦抗病毒能力測試的定量、大規(guī)模感染方法。
背景技術(shù)：
對蝦常見的疾病有白斑綜合病、桃拉病毒病、紅體病和紅腿病等,對蝦疾病一直困擾著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的恢復(fù)和發(fā)展，在對蝦抗病良種選育過程中經(jīng)常需要對養(yǎng)殖對蝦進(jìn)行人工感染實驗，以研究對蝦對疾病的抵抗能力，特別是在對蝦抗病良種選育過程中，需要對大批量對蝦進(jìn)行人工感染實驗，記錄對蝦個體或家系在攝食帶有病毒的餌料后的存活時間，以評判各對蝦個體或家系對該病毒的抵抗力，為抗病良種選育提供有力證據(jù)。但目前對蝦的人工感染方法，主要有1)浸浴感染的方法(邱德全等。斑節(jié)對蝦白斑綜合癥桿狀病毒感染的實驗?zāi)Ｊ?，湛江海洋大學(xué)學(xué)報，2001年/第21卷/5期)，浸浴感染時間長，感染過程中受影響的因素較多，一般認(rèn)為實驗蝦沒有影響，在抗病選育中沒有采用。2)人工注射的方法(謝數(shù)濤等.斑節(jié)對蝦白斑癥的發(fā)病歷程，暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)/2000年/第21卷/第5期)，但此感染的方法是用注射器注射入蝦體內(nèi)病毒液，感染操作繁瑣，技術(shù)要求高。一方面，此方法與對蝦自然感染的方式不符，無法反映對蝦自然感染情況下的抗??；另一方面，對蝦蝦體較小，通過注射的方式難免對蝦體造成傷害，由此可能引起蝦染病而死還是由于外傷感染而死的疑問。3)混養(yǎng)后粗放式投喂毒餌的方法(劉凱于等.對蝦白斑癥病毒的初步研究，華中師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)/2000年/第34卷/第3期)。此方法采用所有實驗個體混養(yǎng)在養(yǎng)殖池中，暫養(yǎng)并停止投喂1-3天后，向養(yǎng)殖池內(nèi)投入含有病毒的飼料顆粒，并記錄投喂時間，以此時間點為計算對蝦個體存活時間的起點，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖池內(nèi)有死亡對蝦立即撈出，記錄死亡時間。由于中國對蝦具有同類蠶食的特點，這種混養(yǎng)后粗放式投喂毒餌的方法在停食期間，體弱、蛻皮的對蝦可能會被其他同類吃掉而丟失有關(guān)信息；另外，全池投喂的結(jié)果不能保證每尾對蝦均攝食(蝦蛻皮時不攝食，已蠶食同類而飽胃的蝦也可能不攝食毒餌)，也不能保證每尾對蝦僅攝食一次，因此無法判斷對蝦在實驗期間是由于攝食毒餌后死亡還是由于養(yǎng)殖環(huán)境中的其它環(huán)境因子導(dǎo)致其死亡，以致不能為抗病良種選育提供準(zhǔn)確的實驗信息。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種對蝦抗病毒能力測試的定量、大規(guī)模感染方法，杜絕對蝦蠶食同類、避免過量感染，以解決目前對蝦抗病力測試過程中因注射、粗放式投喂等原因造成外傷、同類蠶食、過量感染等缺陷，確保為抗病優(yōu)良良種選育提供完整而且準(zhǔn)確的信息。本發(fā)明是按如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種對蝦抗病毒能力測試的定量、大規(guī)模感染方法，具體包括以下步驟I)、感染前的準(zhǔn)備選取體質(zhì)健康、規(guī)格整齊，體長2. 0-2. 5cm的各家系對蝦為測試個體，每個對蝦都具有標(biāo)示，水溫為正常養(yǎng)殖期水溫，按常規(guī)操作正常投喂、換水；2)、感染源制備病源為-80°C保存的自然感染待測病毒發(fā)病的對蝦。取病蝦的鰓，剪碎后按約Ig鰓組織15mL溶液的比例，加入緩沖液，緩沖液的成份為20mmol/LTris-HCl,O. 4mol/L NaCl, 10mmol/L EDT A，pH7. 5，用勻漿機(jī)攪打，制備成勻漿液，用雙層紗布擠壓過濾去粗洛，再在4°C,8000r/min離心15min去沉淀，上清液再在4°C, 15000r/min離心40min，棄去上清液，沉淀加8倍體積的上述緩沖液溶解，即得待測病毒懸液，用無菌生理鹽水以I : 200體積稀釋待測病毒懸液，注射感染經(jīng)PCR檢驗后的健康對蝦，每尾對蝦注射200L，確認(rèn)已感染待測病毒后，取對蝦的鰓和肌肉，用勻漿機(jī)攪勻打碎，制成適合感染對蝦口徑的均勻顆粒；3)、逐尾感染將待測試對蝦分別置于透明塑料容器中，塑料容器底部鋪設(shè)黑色背景以便于觀察，饑餓2小時后，將毒餌投入容器中，觀察對蝦攝食情況；4)、數(shù)據(jù)采集及分析感染結(jié)束后，實驗用對蝦全部轉(zhuǎn)入同一大型混養(yǎng)池中，正常投餌、換水，觀察對蝦死亡情況，從第一尾對蝦死亡開始記錄對蝦死亡時間、體長、體重及家系編號；死亡高峰時,每個小時吸池底一次,并收集死蝦置_80°C保存，實驗廢水施用50ppm有效氯消毒處理后排放，嚴(yán)格操作，以免病毒擴(kuò)散，實驗結(jié)束后，選擇存活率較高的家系的備份留種，感染實驗中長期存活的對蝦同時作為抗病良種轉(zhuǎn)移到新池中培育。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果現(xiàn)有技術(shù)人工注射的方法無法反映對蝦自然感染情況下的抗病性，而且通過注射的方式難免對蝦體造成傷害，由此可能引起蝦染病而死還是由于外傷感染而死的疑問。粗放式投喂毒餌方式一般停食2-3天，由于養(yǎng)殖容器內(nèi)對蝦養(yǎng)殖密度大，且對蝦經(jīng)長時間饑餓后，容易出現(xiàn)對蝦因饑餓而搶食蛻皮、個小、體弱的對蝦，使重要數(shù)據(jù)丟失，攝食了其它同類的對蝦在人工感染測試時可能會不攝食毒餌而最后存活，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)錯誤；同時個體強(qiáng)壯的對蝦可能攝食量大、甚至多次反復(fù)攝食毒 餌，而個體相對較小、體質(zhì)較弱的對蝦可能不能或較少攝食到毒餌，也會導(dǎo)致實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。本發(fā)明優(yōu)化了對蝦人工感染前停食的時間。根據(jù)預(yù)實驗測試，對蝦在攝食后1-2小時內(nèi)，胃及腸道內(nèi)食物及糞便即可全部排空，攝食人工配合餌料后排空時間略長。本發(fā)明在人工感染前2小時停止飼喂對蝦，避免了對蝦因長時間饑餓而出現(xiàn)同類蠶食現(xiàn)象，保證了實驗數(shù)據(jù)和材料的完整性。本發(fā)明利用了簡便的獨立透明塑料容器，在實施對蝦大規(guī)?？共×y試過程中，每尾對蝦置于一個獨立容器內(nèi)，每尾對蝦投喂I次，不但有效避免了對蝦搶食其它同類的現(xiàn)象，而且避免對蝦多次攝食毒餌，避免造成反復(fù)感染、感染量過重而影響測試結(jié)果。由于蝦體透明，容器底部鋪設(shè)黑色背景，便于投餌及攝食觀察。
圖I :用于對單尾對蝦投喂毒餌的獨立小塑料容器，容器底部鋪設(shè)黑布便于觀察。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法內(nèi)容作進(jìn)一步的解釋。本實施例以中國對蝦為實驗對象測試其對白斑綜合征病毒的抗病力，經(jīng)過連續(xù)實驗選育出對WSSV具有較強(qiáng)抵抗力的苗種。2006年5月份在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所遺傳育種中心建立中國對蟲下家系50個，中國對奸長至2. Ocm左右時對各家系個體進(jìn)行可視性突光標(biāo)記(visibleimplant elastomer, VIE),標(biāo)記后養(yǎng)殖至中國對奸體長2. 0-2. 5cm時,每個家系選取30尾進(jìn)行WSSV人工感染實驗，具體方法步驟如下I)、感染前的準(zhǔn)備選取體質(zhì)健康、規(guī)格整齊,體長2. 0-2. 5cm的各家系中國對奸為測試個體，每個中國對蝦都具有家系標(biāo)示，在暫養(yǎng)池中暫養(yǎng)，水溫為正常養(yǎng)殖期的自然水溫，按常規(guī)操作正常投喂、換水。如果5日內(nèi)中國對蝦死亡率超過10%，確認(rèn)中國對蝦的健康狀況不正常，不適合進(jìn)行感染實驗，需重新安排，如果中國對蝦生存正常，則開始感染實驗; 2)、感染源制備病源為本實驗室取自即墨市對蝦養(yǎng)殖場_80°C保存自然感染W(wǎng)SSV發(fā)病的病蝦。取病蝦的鰓，剪碎后按約Ig鰓組織15mL溶液的比例，加入緩沖液(20mmol/L Tris-HCl,O. 4mol/L NaCl, 10mmol/L EDT A，pH7. 5，)，用勻漿機(jī)攪打，制備成勻漿液。用雙層紗布擠壓過濾去粗洛，再在4°C,8000r/min離心15min去沉淀，，再在4°C,, 15000r/min離心40min，沉淀加8倍體積的上述緩沖液溶解，即得WSSV病毒懸液。用無菌生理鹽水以I 200體積稀釋W(xué)SSV病毒懸液，注射感染經(jīng)PCR檢驗后的健康對蝦，每尾對蝦注射200L，確認(rèn)已感染W(wǎng)SSV后，取對蝦的鰓和肌肉，用勻漿機(jī)攪勻打碎，制成直徑為2mm的毒餌顆粒。3)、逐尾感染將待測試對蝦(體長2-2. 5cm)分別置于透明塑料容器中(底面直徑X高=IOcmX 15cm)，容器內(nèi)水位高5cm。塑料容器底部鋪設(shè)黑布。饑餓2小時后，將毒餌投入容器中，觀察對蝦攝食情況。4)、數(shù)據(jù)采集及分析感染結(jié)束后，實驗用中國對蝦全部轉(zhuǎn)入同一大型混養(yǎng)池中(規(guī)格25m2)，水溫調(diào)整為18-28°C，每日按照體重1_2%投喂人工配合飼料，每日投喂4次，換水后投喂，觀察中國對蝦死亡情況。從第一尾對蝦死亡開始記錄對蝦死亡時間、體長、體重及家系編號；每一尾死亡對蝦單獨存放并詳細(xì)記錄死亡時間，死亡高峰時，每3個小時吸池底一次，并收集死蝦置_80°C保存，嚴(yán)格操作，實驗廢水施用50ppm有效氯消毒處理后排放以免病毒擴(kuò)散。感染14天后統(tǒng)計所有樣本，統(tǒng)計家系的存活率結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個家系的存活率在20%以上，8個家系存活率在在10%以上，12個家系存活率在在1-10%，20個家系I %。-I %，其余的5個家系全部死亡。14天內(nèi)，家系內(nèi)個體的存活時間表現(xiàn)出很大的差異，第一尾死亡至最后一位死亡最大相差256個小時。家系存活時間均值從62. 596小時至87. 623，經(jīng)方差分析，家系間的存活時間差異顯著(P < O. 05)，感染14天后，長期存活對蝦轉(zhuǎn)移到新池中作為抗病良種培育，同時選擇存活率較高的13個家系的備份留種。2008年，將應(yīng)用本發(fā)明方法連續(xù)實驗培育的中國對蝦苗種與山東和河北商業(yè)育苗場生產(chǎn)的中國對蝦苗種標(biāo)記后混合養(yǎng)殖對比，結(jié)果顯示，在相同的測試條件下，我們培育的中國對蝦各項測量指標(biāo)平均高于商業(yè)苗種，其中生長速度平均提高35. 85 %，抗WSSV能力平均提高15. 85%。由此充分表明，我們建立的對蝦抗病力測試人工感染方法選育的抗病對蝦，可明顯提高其抗病性能。該方法也為篩選生長快、抗病性強(qiáng)的對蝦良種，縮短新品種的培育周期提高可靠的依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種對蝦抗病毒能力測試的定量、大規(guī)模感染方法，其特征在于具體包括以下步驟 1)、感染前的準(zhǔn)備選取體質(zhì)健康、規(guī)格整齊，體長2.0-2. 5cm的各家系對蝦為測試個體，每個對蝦都具有標(biāo)示，水溫為正常養(yǎng)殖期水溫，按常規(guī)操作正常投喂、換水； 2)、感染源制備病源為_80°C保存的自然感染待測病毒發(fā)病的對蝦；取病蝦的鰓，剪碎后按約Ig鰓組織15mL溶液的比例，加入緩沖液，緩沖液的成份為20mmol/L Tris-HCl,O. 4mol/L NaCl,10mmol/L EDT A, pH7. 5，用勻漿機(jī)攪打，制備成勻漿液，用雙層紗布擠壓過濾去粗渣，再在4°C，8000r/min離心15min去沉淀，上清液再在4°C，15000r/min離心40min，棄去上清液，沉淀加8倍體積的上述緩沖液溶解，即得待測病毒懸液，用無菌生理鹽水以I : 200體積稀釋待測病毒懸液，注射感染經(jīng)PCR檢驗后的健康對蝦，每尾對蝦注射200L，確認(rèn)已感染待測病毒后，取對蝦的鰓和肌肉，用勻漿機(jī)攪勻打碎，制成適合感染對蝦口徑的均勻顆粒； 3)、逐尾感染將待測試對蝦分別置于透明塑料容器中，塑料容器底部鋪設(shè)黑色背景以便于觀察，饑餓2小時后，將毒餌投入容器中，觀察對蝦攝食情況； 4)、數(shù)據(jù)采集及分析感染結(jié)束后，實驗用對蝦全部轉(zhuǎn)入同一大型混養(yǎng)池中，正常投餌、換水，觀察對蝦死亡情況，從第一尾對蝦死亡開始記錄對蝦死亡時間、體長、體重及家系編號；死亡高峰時,每個小時吸池底一次,并收集死蝦置_80°C保存，實驗廢水施用50ppm有效氯消毒處理后排放，嚴(yán)格操作，以免病毒擴(kuò)散，實驗結(jié)束后，選擇存活率較高的家系的備份留種，感染實驗中長期存活的對蝦同時作為抗病良種轉(zhuǎn)移到新池中培育。
全文摘要
一種對蝦抗病毒能力測試的定量、大規(guī)模感染方法，屬于對蝦抗病良種選育領(lǐng)域，包括以下步驟感染前的準(zhǔn)備、感染源制備、逐尾感染、數(shù)據(jù)采集及分析。其中所述的逐尾感染是將待測試對蝦分別置于透明塑料容器中，塑料容器底部鋪設(shè)黑色背景以便于觀察，饑餓2小時后，將毒餌投入容器中，觀察對蝦攝食情況。本發(fā)明利用了簡便的獨立透明塑料容器，在實施對蝦大規(guī)模抗病力測試過程中，每尾對蝦置于一個獨立容器內(nèi)，每尾對蝦投喂1次，不但有效避免了對蝦搶食其它同類的現(xiàn)象，而且避免對蝦多次攝食毒餌，避免造成反復(fù)感染、感染量過重而影響測試結(jié)果。由于蝦體透明，容器底部鋪設(shè)黑色背景，便于投餌及攝食觀察。
文檔編號A01K61/00GK102630610SQ20121010737
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者孔杰, 孟憲紅, 張?zhí)鞎r, 羅坤 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所