專利名稱：五節(jié)芒快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域，涉及植物組織工程技術(shù)，具體地說是一種五節(jié)芒的組織快繁方法。
背景技術(shù)：
五節(jié)芒(Miscanthusf Ioridulus)屬于禾本科(Poaceae)芒屬(Miscanthus Andersson)(陳守良，1997)，是一種高光效的C4植物，具有生物質(zhì)產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)、纖維素含量高、燃燒充分等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種開發(fā)潛力巨大的生物質(zhì)能源植物，在我國主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)(蕭運(yùn)峰，1995)。目前，五節(jié)芒在組織培養(yǎng)有少量報(bào)道，胡恒康等 (植物生理學(xué)通訊，2009)利用種子為外植體，萌發(fā)的小苗切去胚根誘導(dǎo)出叢生芽。刁英等在一種芒屬植物五節(jié)芒體胚組培快速繁殖方法中，以幼穗為外植體，誘導(dǎo)胚性愈傷組織，幼穗取材長度及消毒方法與本發(fā)明不同，并且本發(fā)明誘導(dǎo)愈傷組織過程中使用的培養(yǎng)基等均未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種五節(jié)芒的快速繁殖方法。五節(jié)芒快速繁殖方法，包括如下步驟I)外植體的選擇與滅菌選用五節(jié)芒的幼穗，將幼穗外包裹的多層葉或葉鞘去除，僅保留幼穗外的旗葉，用無菌水清洗3 4次后，在無菌操作臺(tái)上用70%酒精處理 15-30秒,再用O. I %的升汞消毒18 20分鐘,用無菌水沖洗6 7次備用；2)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)將滅菌處理后帶旗葉的幼穗，在超凈臺(tái)剝?nèi)テ烊~，將幼穗切成穗段，接種在MS+2. 0-6. Omg/L 2,4-D+0-0. 2mg/L 6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；在 250-3001ux光照下培養(yǎng)，保持溫度24±2°C，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；(6_8天左右產(chǎn)生愈傷組織)；3)叢生芽誘導(dǎo)及增殖愈傷組織接種在MS+1. 0-4. Omg/L 6_BA的分化培養(yǎng)基；在 20001UX光照下培養(yǎng)，保持溫度24±2°C，直至形成叢生芽；增殖系數(shù)為4以上；4)生根培養(yǎng)以 MS+1. Omg/L IAA+0. lmg/L I BA+1. Omg/L CCC 誘導(dǎo)芽和根。生根率達(dá)95%以上。
步驟I)中所述外植體的選擇取幼穗時(shí)葉枕距為0-2cm。
步驟I)中所述的外植體選用五節(jié)芒處于穎花原基形成期的幼穗。
步驟2)中將幼穗切成O. 3-0. 5cm長度的穗段。
步驟2)中接種瓶(5. 6X6. 9X9. Icm( 口徑X胸徑X高))內(nèi)每瓶接種2_5個(gè)穗段。步驟3)中愈傷組織生長至直徑O. 5-0. 8cm，挑選淡黃色并致密的愈傷組織，接種
在分化培養(yǎng)基。本發(fā)明提出的五節(jié)芒的組織培養(yǎng)方法，采用幼穗外植體，保證了遺傳穩(wěn)定性；避免幼穗直接與酒精和升汞接觸，以免幼穗褐化，降低出愈率；同時(shí)，本發(fā)明方法僅需35天左右形成完整植株，3 5個(gè)月內(nèi)可獲得大量完整植株。
圖I為五節(jié)芒幼穗誘導(dǎo)愈傷組織的圖片；圖2為五節(jié)芒胚性愈傷組織分化的圖片；圖3為五節(jié)芒增殖培養(yǎng)的圖片；圖4為五節(jié)芒生根培養(yǎng)的圖片。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例I取材五節(jié)芒(M. floridulus)02117采自湖南郴州，保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃內(nèi)。I、外植體的選擇與滅菌選用五節(jié)芒優(yōu)良單株，切取葉枕距為O的處于穎花原基形成期的幼穗。首先將幼穗外部葉清除干凈，僅留旗葉，用無菌水清洗3次后，在無菌操作臺(tái)上用70%酒精處理15秒左右,再用O. I %的升汞消毒18分鐘,用無菌水沖洗6次備用；2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)將滅菌處理后帶旗葉的幼穗，在超凈臺(tái)上去除旗葉，將幼穗切成O. 3cm左右的穗段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D2. 0mg/L+6-BA0. lmg/L。 接種瓶內(nèi)每瓶接種5個(gè)穗段，在培養(yǎng)室下300Iux光照，保持溫度24±2°C，培養(yǎng)7天左右誘導(dǎo)出愈傷組織；3、叢生芽誘導(dǎo)及增殖愈傷組織生長至直徑為O. 5cm左右，挑選淡黃色并較為致密的愈傷組織，接種在MS+6-BA2. Omg/L的分化培養(yǎng)基。在20001ux光照下培養(yǎng)，保持溫度 24+2°C，直至形成叢生芽，增殖系數(shù)為4. 6以上；在生根培養(yǎng)基MS+1. Omg/L IAA+0. lmg/ LIBA+1. Omg/L CCC誘導(dǎo)芽和根，生根率達(dá)95%以上，只需35天左右形成完整植株；4、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移栽到天然泥土中，注意保水保濕，移栽I個(gè)月后，移栽成活率達(dá)到90%以上。實(shí)施例2取材五節(jié)芒(M.f Ioridulus) 04405采自安徽馬鞍山，保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃內(nèi)。I、外植體的選擇與滅菌選用五節(jié)芒優(yōu)良單株，切取葉枕距為I. 5cm的幼穗。首先將幼穗外部葉清除干凈，僅留旗葉，用無菌水清洗4次后，在無菌操作臺(tái)上用70%酒精處理 20秒左右,再用O. I %的升汞消毒20分鐘,用無菌水沖洗6次備用；2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)將滅菌處理后帶旗葉的幼穗，在超凈臺(tái)上去除旗葉，將幼穗切成O. 4cm左右的穗段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D4. 0mg/L+6-BA0. 2mg/L。 接種瓶內(nèi)每瓶接種4個(gè)穗段，在培養(yǎng)室下2501ux光照，保持溫度24±2°C，培養(yǎng)7天左右誘導(dǎo)出愈傷組織；3、叢生芽誘導(dǎo)及增殖愈傷組織生長至直徑為O. 7cm左右，挑選淡黃色并較為致密的愈傷組織，接種在MS+6-BA4. Omg/L的分化培養(yǎng)基。在20001ux光照下培養(yǎng)，保持溫度24+2°C，直至形成叢生芽，增殖系數(shù)為4. 8以上；在生根培養(yǎng)基MS+1. Omg/L IAA+0. lmg/ LIBA+1. Omg/L CCC誘導(dǎo)芽和根，生根率達(dá)95%以上，只需35天左右形成完整植株；4、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移栽到天然泥土中，注意保水保濕，移栽I個(gè)月后，移栽成活率達(dá)到90 %以上。實(shí)施例3取材五節(jié)芒(M. floridulus)02155采自湖南常德，保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃內(nèi)。I、外植體的選擇與滅菌選用五節(jié)芒優(yōu)良單株，切取葉枕距為2cm的處于穎花原基形成期的幼穗。首先將幼穗外部葉清除干凈，僅留旗葉，用無菌水清洗4次后，在無菌操作臺(tái)上用70%酒精處理30秒左右，再用O. I %的升汞消毒20分鐘，用無菌水沖洗7次備用；2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)將滅菌處理后帶旗葉的幼穗，在超凈臺(tái)上去除旗葉，將幼穗切成O. 5cm左右的穗段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D6. Omg/L+6-BAOmg/L。接種瓶內(nèi)每瓶接種3個(gè)穗段，在培養(yǎng)室下2501ux光照，保持溫度24±2°C，培養(yǎng)7天左右誘導(dǎo)出愈傷組織；3、叢生芽誘導(dǎo)及增殖愈傷組織生長至直徑為O. 8cm左右，挑選淡黃色并較為致密的愈傷組織，接種在MS+6-BA4. Omg/L的分化培養(yǎng)基。在20001ux光照下培養(yǎng)，保持溫度 24±2°C，直至形成叢生芽，增殖系數(shù)為4. 2以上；在生根培養(yǎng)基MS+1. Omg/L IAA+0. lmg/ LIBA+1. Omg/L CCC誘導(dǎo)芽和根，生根率達(dá)95%以上，只需35天左右形成完整植株；4、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移栽到天然泥土中，注意保水保濕，移栽I個(gè)月后，移栽成活率達(dá)到90%以上。
權(quán)利要求
1.五節(jié)芒快速繁殖方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)外植體的選擇與滅菌選用五節(jié)芒的幼穗，將幼穗外包裹的多層葉或葉鞘去除，僅保留幼穗外的旗葉，用無菌水清洗3 4次后，在無菌操作臺(tái)上用70%酒精處理15-30秒， 再用O. I %的升汞消毒18 20分鐘,用無菌水沖洗6 7次備用；2)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)將滅菌處理后帶旗葉的幼穗，在超凈臺(tái)剝?nèi)テ烊~，將幼穗切成穗段，接種在MS+2. 0-6. Omg/L 2，4-D+0-0. 2mg/L 6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；在 250-3001ux光照下培養(yǎng)，保持溫度24±2°C，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；3)叢生芽誘導(dǎo)及增殖愈傷組織接種在MS+1.0-4. Omg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基；在 20001ux光照下培養(yǎng)，保持溫度24±2°C，直至形成叢生芽；4)生根培養(yǎng)以MS+1. Omg/L IAA+0. lmg/L I BA+1. Omg/L CCC 誘導(dǎo)芽和根。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的五節(jié)芒快速繁殖方法，其特征在于，步驟I)中所述外植體的選擇取幼穗時(shí)葉枕距為0-2cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的五節(jié)芒快速繁殖方法，其特征在于，步驟I)中所述的外植體選用五節(jié)芒處于穎花原基形成期的幼穗。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的五節(jié)芒快速繁殖方法，其特征在于，步驟2)中將幼穗切成O. 3-0. 5cm長度的穗段。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的五節(jié)芒快速繁殖方法，其特征在于，步驟2)中接種瓶內(nèi)每瓶接種2-5個(gè)穗段。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的五節(jié)芒快速繁殖方法，其特征在于，步驟3)中愈傷組織生長至直徑O. 5-0. 8cm，挑選淡黃色并致密的愈傷組織，接種在分化培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了五節(jié)芒快速繁殖方法，以五節(jié)芒的幼穗為外植體，選用五節(jié)芒處于穎花原基形成期的幼穗，滅菌，切成穗段，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.0-6.0mg/L 2，4-D+0-0.2mg/L 6-BA，250-300lux光照下，24±2℃培養(yǎng)，7天左右產(chǎn)生愈傷組織；愈傷組織接種在分化培養(yǎng)基MS+1.0-4.0mg/L 6-BA，2000lux光照下，溫度24±2℃培養(yǎng)，直至形成叢生芽，增殖系數(shù)為4以上；以MS+1.0mg/L IAA+0.1mg/L IBA+1.0mg/L CCC誘導(dǎo)芽和根，生根率達(dá)95％以上，只需35天左右形成完整植株。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102577983SQ20121008058
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者易自力, 艾辛, 蔣建雄, 覃靜萍, 陳智勇 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)