專利名稱：防治西瓜細菌性果斑病生防菌株1jn2及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及防治西瓜細菌性果斑病生防菌株1JN2及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
西瓜細菌性果斑病(Bacterialfruit blotch of watermelon, BFB)是西瓜上的一種危險性檢疫病害，又稱細菌性斑點病，該病最早于1969年由Crall和Schenck在美國佛羅里達州發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時只是對果斑病癥狀進行了描述，未做病原菌的鑒定；目前為止，在我國許多省市，像新疆，陜西，河北，山西，吉林，福建，甘肅等地都已有果斑病的報道。該病害主要危害果實，引起西瓜果實腐爛等，可造成毀滅性損失，一旦發(fā)病用藥防治基本沒有效果。而且?guī)ЬN子將成為下一年重要的初侵染源。該病的發(fā)生嚴重影響了西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，成為西瓜生產(chǎn)上亟待解決的難題之一。該病害是由燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovorax avenae subsp. citrulli, Aac)引起的，西瓜果斑目前在瓜類作物中無免疫品種。西瓜細菌性果斑病是一種毀滅性的細菌性病害，大田生長期不易被發(fā)現(xiàn)，且發(fā)病突然、發(fā)展迅速，由于目前還沒有發(fā)現(xiàn)種子處理的更好方法，目前生產(chǎn)中所采用的化學(xué)藥劑有農(nóng)用鏈霉素，可殺得，新植霉素，細菌殺，葉雙青， 加瑞農(nóng)，琥膠肥酸銅等，雖然化學(xué)藥劑對該病有一定的防治效果，但是防治效果不高，而且大量使用化學(xué)殺菌劑往往會造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留，以及引起病原菌抗藥性等問題。生物防治是一種安全有效的防治手段，符合農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的方向。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的針對西瓜產(chǎn)業(yè)潛在危害較大的西瓜細菌性果斑病，提供開發(fā)一種防治西瓜細菌性果斑病的單一生防菌菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)一種防治西瓜細菌性果斑病病害的生防菌株1JN2，分類命名為Bacillus axarquiensis, 2012年I月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO. 5731。用所述的保藏號為CGMCC NO. 5731的生防菌株1JN2制備的生防菌劑。所述的保藏號為CGMCC NO. 5731的生防菌株1JN2在防治西瓜細菌性果斑病中的應(yīng)用。所述保藏號為CGMCC NO. 5731的生防菌株IJN2用于制備生防菌劑的方法將所述的保藏號為CGMCC NO. 5731的防治西瓜細菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培養(yǎng)液中 280C 180rpm振蕩培養(yǎng)12_16h，然后6000rpm離心lOmin，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為I X IO9-I X 101QCFU/mL。所述的保藏號為CGMCC NO. 5731的生防菌株1JN2制備的生防菌劑在防治西瓜細菌性果斑病中的應(yīng)用。該菌劑可以兌水噴霧使用，或做成堆肥使用，也可稀釋后在移栽時灌根。有益效果本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明是專門針對西瓜細菌性果斑病病害開發(fā)的生防制劑。由于是生物制劑，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于西瓜的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學(xué)農(nóng)藥的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開支，而且有利于西瓜的出口貿(mào)易。溫室大棚試驗結(jié)果顯示，含1JN2(CGMCC NO. 5731)的生防菌劑對西瓜的促生作用效果顯著，生物量增加達到55. 92% (表I)，并且該生防菌劑對西瓜果斑病病害防效顯著， 高達 50. 13% (表 2)。生物樣品保藏信息生防菌株1JN2,分類命名為Bacillus axarquiensis,于2012年I月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO. 5731。
具體實施例方式實施例I—種防治西瓜細菌性果斑病病害的生防菌株1JN2,為Bacillus axarquiensis,由山東省萊蕪市生姜莖內(nèi)分離得到。其具體分離、篩選、鑒定方法如下I生防菌株IJN2的分離剪掉生姜莖部3g，用1%的次氯酸鈉ImL浸5min，70%酒精浸2min，無菌水清洗3 次。(取最后一次清洗的溶液0. ImL涂R2A,或取0. ImL最后一次清洗液加入R2A培養(yǎng)液， 30°C振蕩培養(yǎng)，若48h后無菌生長則認為表面消毒干凈)。用滅菌的研砵研碎表面消毒好的莖，加3mL無菌水，無菌棉布過濾，用無菌水稀釋10倍，取0. ImL涂LB平板，每個點重復(fù) 3次，28°C培養(yǎng)48h，計數(shù)，挑取平板上所有的菌落分離純化，-70°C、40%甘油保存?zhèn)溆谩?生防菌株1JN2的篩選 將西瓜細菌性果斑病病原菌燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovoraxavenae) FC440(JianjunFeng, Erin L. Schuenzel, Jianqiang Li, and Norman ff. Schaad. 2009. Multilocus Sequence Typing Reveals Two Evolutionary Lineages of Acidovorax avenae subsp. Citrulli. Bacteriology. 99 (8) :913-920)在 LB 培養(yǎng)液(氯化鈉 lOg/L,膜蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 2)中培養(yǎng)16-24h至CFU為108/ml)，加入熔化冷卻至40°C左右的固體培養(yǎng)基中，體積比I : 200，將培養(yǎng)基每20mL倒入9cm直徑的平板中。待冷卻凝固后，牙簽接種生防菌1JN2。置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后記錄抑菌圈環(huán)徑，挑取抑菌圈最大的命名為1JN2，于2012年I月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為 CGMCC NO. 5731。3生防菌株1JN2的鑒定3. I生防菌株1JN2的形態(tài)特征菌落扁平、灰白色，邊緣波紋狀，較粘稠，菌體直桿狀，大小為2. 0 X 0. 5 ii m，單生、
4對生或成短鏈狀、絲狀，周生多根鞭毛，內(nèi)生孢子為橢圓形，在末端未膨大的孢子囊中，好氣性，革蘭氏反應(yīng)陽性。3. 2生防菌株1JN2的生理生化特征將生防菌1JN2活化在LB平板上(氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L， 調(diào)節(jié)pH值為7. 2)，28°C培養(yǎng)24h，用牙簽挑取單菌落分別接種到蛋白酶，幾丁質(zhì)酶，纖維素酶，以及嗜鐵素酶活測定的平板上，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3d，測量透明圈直徑的大小。表I. Bacillus axarquiensis 1JN2 的生理生化特征
菌株編號蛋白酶透明圈直徑 (cm)幾丁質(zhì)酶透明圈直徑(cm)纖維素酶透明圈直徑(cm)嗜鐵素透明圈直徑 (cm)1JN2203I3. 3生防菌株1JN2的分子學(xué)鑒定細菌基因組試劑盒(賽百盛公司)提取細菌基因DNA后，用gyrB通用引物 gyrBl (SEQ ID NO. I) ；gyrB2R(SEQ ID NO. 2)從基因組 DNA 中擴增出 gyrB 基因片段。具體擴增體系及程序(25ul)如下引物 gyrB U gyrB2R (IOuM)各 I yl ；Mix 12. 5u I ；Taq 0. 5u I0 ddH20 :10 ill ;模板1 ill。94°C 預(yù)變性 5min，94°C 變性 lmin，56°C 退火 2min，72°C 延伸2min，35個循環(huán)，72°C延伸lOmin，4°C保存。PCR擴增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，90V，30min ；EB染色30min，檢測擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物純化后連接到pMD19_T載體，轉(zhuǎn)化于 Escherichia coliDH5 a ,提取陽性克隆質(zhì)粒,委托TaKaRa公司測序,提交NCBI (National Center for Biotechnology Information)進行比對。與登錄號為 DQ903178. I 的 Bacillus axarquiensis strain LMG 22476DNA gyrase subunit B(gyrB)基因比對，相似度為99%， 因此鑒定 1JN2 為 Bacillus axarquiensis。實施例2蠟質(zhì)芽孢桿菌1JN2生防菌劑的制備將上述防治西瓜細菌性果斑病的生防菌株1JN2(CGMCC NO. 5731)在LB培養(yǎng)液 280C 180rpm振蕩培養(yǎng)12_16h，然后6000rpm離心lOmin，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為I X IO9-I X 101(lCFU/mL，以下稱該生防菌劑為蠟質(zhì)芽孢桿菌1JN2生防菌劑。實施例3蠟質(zhì)芽孢桿菌1JN2溫室促生試驗將催芽后的西瓜種子播種于裝有無菌土壤中盆砵中，每盆一粒，16/8h光周期。待西瓜長到6葉期時，將懸浮好的蠟質(zhì)芽孢桿菌1JN2生防菌劑(實施例2制備，下同)以 108CFU/ml的濃度用手動式噴器將該菌成霧狀噴施于葉片的表面，使葉片濕潤而菌劑又恰好不流下來。置于溫室中培養(yǎng)，28°C，70%相對濕度以上，生防菌接種30天后，分別取處理組和對照組植株，小心剔除根部土壤，清洗干凈后，自然風(fēng)干，分別統(tǒng)計地上部長，地下部長，植株鮮重。6CTC,烘干72h后測量植株干重。生物量增加(％ )=(處理組植株干重-對照植株干重)/對照植株干重X 100 %表2. Bacillus axarquiensis 1JN2對西瓜苗期的促生作用
權(quán)利要求
1.一種防治西瓜細菌性果斑病的生防菌株1JN2，分類命名為Bacillus axarquiensis,于2012年I月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCN0. 5731。
2.用權(quán)利要求I所述的保藏號為CGMCCNO. 5731生防菌株1JN2制備的生防菌劑。
3.權(quán)利要求I所述的保藏號為CGMCCNO. 5731生防菌株1JN2在防治西瓜細菌性果斑病中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述生防菌株1JN2用于制備生防菌劑的方法，其特征在于將權(quán)利要求I所述防治西瓜細菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培養(yǎng)液中28°C 180rpm振蕩培養(yǎng) 12-16h，然后6000rpm離心lOmin，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為 lX109-lX101QCFU/mL。
5.權(quán)利要求2所述生防菌劑在防治西瓜細菌性果斑病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)作物防病治病技術(shù)領(lǐng)域，公開了防治西瓜細菌性果斑病生防菌株1JN2及其應(yīng)用。生防菌株1JN2，分類命名為Bacillus axarquiensis，2012年1月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.5731。將該菌在LB培養(yǎng)液中28℃180rpm振蕩培養(yǎng)12-16h，然后6000rpm離心10min，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1×109-1×1010CFU/mL。溫室大棚試驗結(jié)果顯示，含1JN2的生防菌劑對西瓜的促生作用效果顯著，生物量增加達到55.92％，并且該生防菌劑對西瓜果斑病病害防效顯著，高達50.13％。
文檔編號A01P1/00GK102604869SQ20121007933
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者武芳, 蔣春號, 郭堅華 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)