專利名稱：彩棉體細胞胚狀體的萌發(fā)及成苗方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物組織的萌發(fā)及成苗方法，具體涉及彩棉體細胞胚狀體的萌發(fā)及成
苗方法。
背景技術：
隨著基因工程和分子生物學技術的發(fā)展，以常規(guī)育種方法為基礎，以轉基因技術為核心技術的現(xiàn)代育種技術體系，能夠將外源有益基因導入棉花細胞，并使其定向而穩(wěn)定的遺傳，結合分子標記輔助選擇技術，可以加快育種進度，提高選擇效率。棉花組織培養(yǎng)理論和技術的發(fā)展，對于研究體細胞分化和形態(tài)建成的機理、細胞基因的表達和調控及進行遺傳操作具有重要的意義。棉花組織培養(yǎng)具有一定的難度，通過外植體誘導體細胞胚胎萌發(fā)存在周期較長、胚發(fā)生率低、生根困難、基因型依賴性強等特點。在棉花體細胞胚胎分化階段主要包括球形胚，心形胚，魚雷胚和子葉胚等四個階段，其中球形胚、心形胚、魚雷前期胚均不能萌發(fā)成苗，只有子葉胚和魚雷后期的胚可以萌發(fā)成小植株。因此選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，獲得更多的子葉胚和魚雷胚是胚性愈傷分化培養(yǎng)的重要目標。研究表明棉花胚性愈傷組織成熟分化后部分體胚分化成苗，大部分胚性愈傷組織轉化為非胚性愈傷組織，最終喪失體細胞胚胎的發(fā)生能力。在胚性愈傷組織發(fā)育初期，胚狀體分化主要以球形胚為主，若不加入任何激素，胚性愈傷組織會一直停留在球形胚階段，很難分化成苗，加入細胞分裂素類物質對棉花胚性愈傷組織增殖作用影響不大，但對棉花體細胞胚后期萌發(fā)有促進作用，因此棉花體細胞胚的誘導培養(yǎng)基中要添加不同組份的外源激素，促進胚胎萌發(fā)和分化。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷，克服了彩棉外植體誘導體細胞胚胎萌發(fā)存在周期較長、胚發(fā)生率低、生根困難、基因型依賴性強的缺陷，提供了彩棉體細胞胚狀體的萌發(fā)方法及成苗方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為彩棉體細胞胚狀體的萌發(fā)方法，包括有以下步驟I)以彩棉下胚軸培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織，通過增殖培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)1-2次；2)將步驟I)得到的胚性愈傷組織轉接至體胚誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2-3次后，得到成熟的子葉胚。上述彩棉體細胞胚狀體的萌發(fā)方法，所述步驟2)中，體胚誘導培養(yǎng)基的組成為 去除NH4NO3的MSB培養(yǎng)基中加入O. 1-0. 3mg/L的N6-異戊烯腺嘌呤和O. 3-0. 5mg/L的吲哚丁酸，并添加I. 9-3. 8g/L的KNO3U. 5-2. Og/L的植物凝膠、O. 1-0. 5g/L的谷氨酰胺和 O. I-ο. 5g/L的天門冬酰胺。本發(fā)明的第二個目的是提供了 彩棉體細胞胚狀體的成苗方法，包括有以下步驟
I)以彩棉下胚軸培養(yǎng)獲得成熟的子葉胚轉接至分化培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)2-3次后，分化成苗；2)將步驟I)得到的再生苗轉接至繼代培養(yǎng)基中，20-25天繼代I次，直至生根；上述彩棉體細胞胚狀體的成苗方法，所述步驟3)中，成苗培養(yǎng)基的組成為 1/4-1/2的MSB培養(yǎng)基，添加2. 0-2. 5g/L的植物凝膠、O. 1-0. 5g/L的天冬酰胺和O. 1-0. 5g/ L的谷氨酰胺。體細胞胚胎發(fā)生是棉花組織培養(yǎng)的關鍵步驟，如果在不加激素的培養(yǎng)基上持續(xù)的繼代培養(yǎng)，理論上講是可以實現(xiàn)細胞的胚胎發(fā)生，但是體細胞胚的數(shù)量很少，而且多數(shù)的胚胎會持續(xù)停留在球形胚的階段。在成熟的體細胞胚的萌發(fā)和生長過程中，培養(yǎng)基中高鹽分是胚狀體成熟、萌發(fā)和生根最大的障礙，低鹽分是棉花體細胞胚狀體有效萌發(fā)的重要條件。 因此，在棉花體細胞培養(yǎng)過程中，按照體胚培養(yǎng)發(fā)育階段適當降低培養(yǎng)基中大量元素中鹽的的濃度，才能獲得良好的結果。本方法也證實了這一點，去除NH4NO3有利于體細胞胚胎的發(fā)生，后期有效胚胎的發(fā)生及子葉胚萌發(fā)成苗則需要降低MS中的無機鹽成分。同時根據(jù)張寶紅等的研究，對棉花體細胞胚胎發(fā)生具有促進作用的物質物質有IBA、ABA、IAA、BA、KT、ZT 和ZiP，其效果依上述次序遞增。本研究通過對IBA濃度設置梯度，證實了高濃度的IBAJg 濃度的KT的組合最有利于胚性愈傷分化。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明所提供的彩棉體細胞胚狀體有效萌發(fā)和成苗方法，是針對彩棉品系胚性愈傷向體胚的分化以及后期萌發(fā)成苗研究出的最適條件。此方法通過調節(jié)外源激素，使胚性愈傷組織向體胚的轉化率達到95%，其中子葉胚分化率高達70%，有效提高了體胚發(fā)育階段中子葉胚的分化率。成苗培養(yǎng)基則是通過降低無機鹽濃度，改變植物凝膠使用量，使子葉胚可正常萌發(fā)成苗，解決了生根困難的問題，有效縮短了轉基因再生苗的培養(yǎng)時間。本方法主要為彩色棉體細胞胚狀體萌發(fā)及后期成苗提供一個切實可行的培養(yǎng)方法，為開展彩色棉的轉基因育種工作奠定基礎。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案材料中所提及的的MSB培養(yǎng)基,是一種常規(guī)培養(yǎng)基,其主要成分及用量如表I所示表I
權利要求
1.彩棉體細胞胚狀體的萌發(fā)方法，其特征在于，包括有以下步驟O以彩棉下胚軸培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織，通過增殖培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)1-2次；2)將步驟I)得到的胚性愈傷組織轉接至體胚誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2-3次后，得到成熟的子葉胚。
2.根據(jù)權利要求I所述的彩棉體細胞胚狀體的萌發(fā)方法，其特征在于所述步驟2)中， 體胚誘導培養(yǎng)基的組成為去除NH4NO3的MSB培養(yǎng)基中加入O. 1-0. 3mg/L的N6-異戊烯腺嘌呤和O. 3-0. 5mg/L的吲哚丁酸，并添加I. 9-3. 8g/L的KN03、1. 5-2. Og/L的植物凝膠、O.l-ο. 5g/L的谷氨酰胺和O. 1-0. 5g/L的天門冬酰胺。
3.彩棉體細胞胚狀體的成苗方法，其特征在于，包括有以下步驟O以彩棉下胚軸培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織，通過增殖培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)1-2次；2)將步驟I)得到的胚性愈傷組織轉接至體胚誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2-3次后，得到成熟的子葉胚；3)將步驟2)得到的子葉胚轉接至成苗培養(yǎng)基，20-25天繼代I次，直至分化成苗。
4.根據(jù)權利要求3所述的彩棉體細胞胚狀體的成苗方法，其特征在于所述步驟3)中， 成苗培養(yǎng)基的組成為1/4-1/2的MSB培養(yǎng)基，添加2. 0-2. 5g/L的植物凝膠、O. 1-0. 5g/L的天冬酰胺和O. 1-0. 5g/L的谷氨酰胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了彩棉體細胞胚狀體的萌發(fā)和成苗方法，包括有以下步驟1)以彩棉下胚軸培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織，通過增殖培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)1-2次；2)將步驟1)得到的胚性愈傷組織轉接至體胚誘導培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2-3次后，得到成熟的子葉胚；3)將步驟2)得到的子葉胚轉接至成苗培養(yǎng)基，20-25天繼代1次，得到正常生根的分化苗。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明所提供的彩棉體細胞胚狀體萌發(fā)和成苗方法，使胚性愈傷組織向體胚的轉化率達到95%，其中子葉胚分化率高達70%，有效提高了體胚發(fā)育階段中子葉胚的分化率，解決了彩棉體細胞胚胎發(fā)生及成苗困難的問題，為彩棉轉基因研究應用提供技術支撐。
文檔編號A01H4/00GK102577980SQ20121007129
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權日2012年3月16日
發(fā)明者劉新星, 厚毅清, 曲延英, 李忠旺, 羅俊杰, 陳子萱, 陳玉梁 申請人:甘肅省農業(yè)科學院生物技術研究所