專利名稱：一種姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食用菌培植技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
姬菇(Pleurotus cornucopiae)又叫黃白側(cè)耳、紫孢側(cè)耳、紫孢平菇、姬平菇。姬菇口感好，質(zhì)地脆嫩，味道鮮美營養(yǎng)價值高，蛋白質(zhì)含量高于一般蔬菜，含有人體所必需的八種氨基酸，其子實體入藥有滋補強壯作用，可治療多種疾病。姬菇不是分類上的名稱，也不是菌種名，而是一種商品名，指采收子實體菌蓋直徑小于3厘米的一類平菇。姬菇一直使用固體菌種進(jìn)行生產(chǎn)，但固體菌種具有明顯的缺陷，主要表現(xiàn)在生長周期長、菌齡不一致、 發(fā)菌速度慢、栽培種需用量大、生產(chǎn)成本高等方面，顯然不能滿足大規(guī)模栽培使用需求。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，以滿足高效培育姬菇的使用需求。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)取活化的0. 5cm2斜面母種接種到裝有60 120mL液體培養(yǎng)基的250mL培養(yǎng)瓶中，控溫21 27°C，90 180rpm振蕩培養(yǎng)5 7d得一級搖瓶菌種，按接種量為5 10% 轉(zhuǎn)接一級種子到二級培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，再將培養(yǎng)好的二級搖瓶液體菌種轉(zhuǎn)接到三級液體培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，相同方法依次進(jìn)行各級培養(yǎng)得種子液；其中，各級搖瓶培養(yǎng)條件相同，液體培養(yǎng)基配方為碳源，氮源 10 20g, KH2PO4 1 3g，MgSO4 ·7Η20 0· 5 1. Sg5VB1 10mg，水 1000mL,pH5 7 ；碳源為20 30g的可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇或蔗糖；氮源為酵母膏、蛋白胨、玉米粉、氯化銨、硫酸銨或尿素；(2)將步驟(1)所得的種子液按5%的接種量接種至裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的IOL發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，25°C培養(yǎng)5 6d，即可；其中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為甘露醇30g，酵母膏 IOg,玉米粉 10g, KH2PO4 2g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, pH 值 6· 0，水 1OOOmL0步驟(1)中，碳氮比優(yōu)選為18 20 1 ；碳源優(yōu)選為果糖或甘露醇，更優(yōu)選為甘露醇。步驟(1)中，氮源優(yōu)選為酵母膏、蛋白胨或氯化銨，更優(yōu)選為酵母膏。步驟(1)中，液體培養(yǎng)基優(yōu)選配方為30g甘露醇，IOg酵母膏，玉米粉10g，2g KH2PO4,0. 5g MgSO4 · 7H20, VB1 10mg，水 1OOOmL, pH6。步驟(1)中，優(yōu)選培養(yǎng)條件裝液量為90mL，控溫25°C，150rpm振蕩培養(yǎng)5 6d，
接種量為5%。有益效果與現(xiàn)有的固體培養(yǎng)姬菇菌種方法相比，本發(fā)明的姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法具有的明顯優(yōu)勢包括生產(chǎn)周期短、菌齡一致、生產(chǎn)成本低、接種簡便，液體菌種生長速度明顯優(yōu)于固體傳統(tǒng)栽培種，菌種瓶中菌絲生長滿瓶時間為16d，時間明顯縮短，液體菌種接種的生長速度明顯提高75%，完全可以在工廠生產(chǎn)中實際應(yīng)用，具有很好的實用性， 能夠產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效應(yīng)。
圖1是碳源對菌絲球生長量結(jié)果圖；圖2是氮源對菌絲球生長量結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。以下實施例所使用的材料和方法為試驗材料菌種為姬菇。按照有機(jī)肥料中國人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY525-2002測定各種原料含碳量和
含氮量。菌絲體生物量測定將生長良好、無污染的搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液，經(jīng)4層紗布過濾，菌絲球生物量濕重為浙干后取固體物在電子天平上稱重，菌絲球生物量干重則是直接過濾烘干稱重。菌球直徑測定取ImL發(fā)酵液用水稀釋10倍，隨機(jī)取20個菌球在培養(yǎng)皿中沿固定的直線排成一行，用卡尺測定總長度，重復(fù)3次，求其平均值。菌球密度測定取ImL均勻的發(fā)酵液用水稀釋10倍，于培養(yǎng)皿下墊置黑色方格紙計數(shù)。pH值測定采用型酸度計測定pH值。還原糖測定取發(fā)酵液上清液按3，5- 二硝基水楊酸比色法測定還原糖。菌絲生長速度固體栽培種或是液體菌種相同接種量接種后，觀察菌絲在菌種瓶中萌發(fā)，向下生長，直至生長至瓶底的時間，即滿瓶時間。發(fā)酵罐參數(shù)測定IOL全自動氣升式攪拌玻璃發(fā)酵罐裝液量為6L，以搖瓶試驗得出的最佳液體培養(yǎng)基配方配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐中經(jīng)過空消和發(fā)酵罐自身蒸汽 121°C下滅菌30min，待罐內(nèi)培養(yǎng)基溫度下降至25°C左右，按照5%接種量接種已經(jīng)活化好的液體菌種種子液，通入無菌空氣開始控制培養(yǎng)發(fā)酵。按1 為間隔定時無菌取樣，其菌絲球生物量、菌絲球密度、菌絲球直徑，溶氧濃度和pH值以電極測量。實施例1取活化的斜面母種約0. 5cm2的小塊接種到液體培養(yǎng)基中，于25°C恒溫振蕩培養(yǎng)得一級搖瓶菌種，再將培養(yǎng)好的一級搖瓶液體菌種轉(zhuǎn)接到各處理的二級液體菌種搖瓶中，依次進(jìn)行各級培養(yǎng)，若無特殊說明，各級搖瓶培養(yǎng)條件均為250mL三角瓶裝液量IOOmL,接種量5% (V/V)，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，25°C振蕩培養(yǎng)5 7d,同樣，其余各級液體菌種也是相同的培養(yǎng)方式。姬菇液體菌種的液體培養(yǎng)基配方為氮源，碳源，KH2PO4 3g,MgSO4 ·7Η20 1. 5g， VB1 10mg，水lOOOmL，pH自然，121°C滅菌20min。用作姬菇斜面培養(yǎng)的PDA通用培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g，蔗糖20g，水IOOOmL, pH自然，121°C滅菌20min，。(1)在液體培養(yǎng)基中，氮源為20g蛋白胨，碳源選擇30g的可溶性淀粉(上海佳和生物科技有限公司)、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇和蔗糖分別進(jìn)行培養(yǎng)。對姬菇液體菌種菌絲球生物量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示，在所測碳源中，姬菇在甘露醇為碳源的培養(yǎng)基中生長最好，其余依次是果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉，以甘露醇和果糖兩個單糖利用率較好，因此，在生產(chǎn)中優(yōu)選使用甘露醇和果糖。( 在液體培養(yǎng)基中，碳源為30g甘露醇，氮源選擇20g的酵母膏、蛋白胨、玉米粉、 氯化銨、硫酸銨和尿素分別在25°C下?lián)u瓶培養(yǎng)，測定姬菇液體菌絲球生物量，結(jié)果如圖2所示，姬菇生長最優(yōu)的氮源是酵母膏，其次是蛋白胨，氯化銨，最后是硫酸銨和尿素，酵母膏不但含有穩(wěn)定的氮素含量，并且同時提供穩(wěn)定的有機(jī)營養(yǎng)和生長因子類物質(zhì)。姬菇可能偏向于利用較為復(fù)雜的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)作為自身生長合適的碳氮源，能夠提供碳氮源需要的同時并提供必須的生長因子和代謝調(diào)控物質(zhì)等，因此，優(yōu)選以甘露醇作為姬菇液體培養(yǎng)基的碳源，以酵母膏為最佳氮源。(3)在液體培養(yǎng)基中，選用甘露醇、酵母膏分別作為碳氮源，磷酸氫二鉀，硫酸鎂為無機(jī)鹽，PH自然，采用正交設(shè)計L9(34)進(jìn)行培養(yǎng)實驗，如表1所示，表中，A為甘露醇％ (質(zhì)量百分比)，B為酵母膏％ (質(zhì)量百分比)，C為KH2PO4^ (質(zhì)量百分比)，D為MgS04*7H20% (質(zhì)量百分比)。表1 L9 (34)因素表
權(quán)利要求
1.一種姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取活化的0.5cm2斜面母種接種到裝有6(Tl20mL液體培養(yǎng)基的250mL培養(yǎng)瓶中，控溫2廣27°C，90^180rpm振蕩培養(yǎng)5 7d得一級搖瓶菌種，按接種量為5 10%轉(zhuǎn)接一級種子到二級培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，再將培養(yǎng)好的二級搖瓶液體菌種轉(zhuǎn)接到三級液體培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，相同方法依次進(jìn)行各級培養(yǎng)得種子液；其中，各級搖瓶培養(yǎng)條件相同，液體培養(yǎng)基配方為碳源，氮源 10 20g，KH2PO4 廣3g，MgSO4 · 7Η200· 5 1. 5g，VB1 IOmg,水 IOOOmL, pH5 7 ；碳源為2(T30g的可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇或蔗糖；氮源為酵母膏、蛋白胨、玉米粉、氯化銨、硫酸銨或尿素；(2)將步驟(1)所得的種子液按5%的接種量接種至裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的IOL發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，25°C培養(yǎng)5飛d，即可；其中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為甘露醇30g，酵母膏10g，玉米粉 10g, KH2PO4 2g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, pH 值 6· 0，水 IOOOmL0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)中，碳氮比為18 20:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)中，碳源為果糖或甘露醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)中，碳源為甘露醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)中，氮源為酵母膏、蛋白胨或氯化銨。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)中，氮源為酵母膏。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)中，液體培養(yǎng)基配方為:30g甘露醇，IOg酵母膏，玉米粉10g，2g KH2PO4,0. 5g MgSO4 · 7H20, VB110mg,7jC IOOOmL, pH 6。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(1)中，培養(yǎng)條件裝液量為90mL，控溫25°C，150rpm振蕩培養(yǎng)5 6d，接種量為5%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種姬菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括(1)取斜面母種接種到裝有60~120mL液體培養(yǎng)基的250mL培養(yǎng)瓶中，控溫21~27℃，90~180rpm振蕩培養(yǎng)5~7d得一級搖瓶菌種，按接種量為5~10%轉(zhuǎn)接一級種子到二級培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，再將培養(yǎng)好的二級搖瓶液體菌種轉(zhuǎn)接到三級液體培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，相同方法依次進(jìn)行各級培養(yǎng)得種子液；(2)將種子液按5%的接種量接種至裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，25℃培養(yǎng)5~6d，即可。該方法生產(chǎn)周期短、菌齡一致、生產(chǎn)成本低、接種簡便，液體菌種生長速度明顯優(yōu)于固體傳統(tǒng)栽培種，菌種瓶中菌絲生長滿瓶時間為16d，時間明顯縮短，液體菌種接種的生長速度明顯提高75%，完全可以在工廠生產(chǎn)中實際應(yīng)用。
文檔編號A01G1/04GK102550294SQ20121002390
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月3日
發(fā)明者劉耀鴻, 劉輝, 華國棟, 孟德龍, 李冠喜, 溫以斌, 王多明 申請人:連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院