專利名稱：中國地生蘭花原生細胞胚超聲波破壁培養(yǎng)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中國地生蘭花細胞組織培養(yǎng)方法，特別是被培養(yǎng)蘭花原生細胞胚發(fā)育啟動前的預處理方法，中國地生蘭花原生細胞胚超聲波破壁培養(yǎng)法。
背景技術(shù)：
中國地生蘭花種子極細，細如塵埃，種子內(nèi)僅有一個發(fā)育不完全的胚，沒有胚芽和胚乳，不具備種子的基本結(jié)構(gòu)，沒有供其萌發(fā)的營養(yǎng)物質(zhì)，還不能稱其為種子，只能稱其為原生細胞胚，加之有一層翅羽狀種皮，種皮不易吸收水分。如，蓮瓣蘭種子泡在水中三年以上也不能吸收到水分和外部提供的營養(yǎng)物質(zhì)，在自然界中必須靠某種真菌菌絲穿透其種皮為其提供營養(yǎng)才能萌發(fā)，不同的蘭花所需的真菌各不相同，人們至今未能分離到能作用于中國蘭花的真菌。經(jīng)過近30年研究，僅僅分離到可供腐生蘭天麻萌發(fā)的小菇真菌。所以， 人工繁殖天麻得以成功，其他蘭花還不能自然繁殖，用常規(guī)方法播種不能萌發(fā)，故需要人工突破種皮后再由培養(yǎng)基來供給養(yǎng)份才能使原生細胞胚萌發(fā)。突破種皮的現(xiàn)有技術(shù)是用氫氧化鈉溶液或酸溶液來浸泡腐蝕種皮，破皮后氫氧化鈉溶液或酸溶液同時也腐蝕了細胞胚， 使其失活，難以控制得恰到好處，成功率極低。目前只是理論上的做法，尚不能達到實用目的。這也是中國地生蘭花至今不能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的原因之一。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對中國地生蘭花種子難以自然發(fā)芽、人工繁育種苗難的問題， 提出一種采用簡單的物理作用，在不使用腐蝕性液體的條件下突破蘭花種皮，同時對中國地生蘭花原生細胞胚的損傷較小、培養(yǎng)成功率高的中國地生蘭花原生細胞胚超聲波破壁培養(yǎng)法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的這種中國地生蘭花原生細胞胚超聲波破壁培養(yǎng)法，其特征在于它有如下步驟
選用尚未開裂的蘭花果實，表面用75%的酒精滅菌后，取出種子，用10%次氯酸鈉浸泡 5 10分鐘，取出再用無菌水沖洗3次完成表面消毒后，在無菌操作臺上切開果子，將其中的原生細胞胚粉粒倒入無菌水中，在旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)，促其與水親和后，倒入消毒無菌的超聲波震蕩容器中反復震蕩直至在顯微鏡下觀察到翅羽狀種皮受超聲波能量破壞破裂后，再用吸管吸入事先準備好的培養(yǎng)基中進行無菌培養(yǎng)。上旋轉(zhuǎn)搖床前，按每IOOml無菌水中滴入0. 5ml表面活性劑吐溫80。震蕩方式是震蕩1分種后靜置3分鐘，再震蕩1分種后靜置3分鐘，如此反復重復該過程。震蕩容器震蕩頻率為42000HZ。應用該方法預處理后，除了豆瓣蘭系，蓮瓣蘭系春劍系和兜蘭系4個品系國蘭未能啟動成功以外，申請人在四年的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)出了春蘭，寒蘭，綠蘭，秋枝，墨蘭，劍葉蘭的根狀莖龍根，分化出了完整的植株。證明本發(fā)明對于破解蘭花種皮，促使蘭花種子(原生細胞胚)發(fā)芽是完全可行的。對于實現(xiàn)中國地生蘭花的人工育種栽培，挽救瀕危蘭花物種具有重大意義。
圖1經(jīng)本發(fā)明處理的秋枝蘭原生細胞胚培養(yǎng)180后根狀莖啟動實況圖。圖2是經(jīng)本發(fā)明處理的綠蘭原生細胞胚培養(yǎng)300天后根狀莖分化成植株實況圖。圖3是經(jīng)本發(fā)明處理的劍葉蘭培養(yǎng)苗移栽80天后實況圖。
具體實施例方式下面用實例進一步說明本發(fā)明的積極效果。從2007年開始，先后對春蘭，寒蘭，綠蘭，秋枝，墨蘭，劍葉蘭六種中國地生蘭花種果實，用本發(fā)明方法進行實驗，處理后用通常的培養(yǎng)方法培育，獲得了成功。每種蘭花種子的處理過程均如下
選用尚未開裂的蘭花果實，表面用75%的酒精滅菌后，取出種子，用10%次氯酸鈉浸泡 5 10分鐘，取出再用無菌水沖洗3次完成表面消毒后，在無菌操作臺上切開果子，將其中的原生細胞胚粉粒倒入IOOml無菌水中，滴入0. 5ml表面活性劑吐溫80，在旋轉(zhuǎn)搖床上處理 (旋轉(zhuǎn))1分鐘，促其與水親和后，后倒入消毒無菌的超聲波震蕩容器中，震蕩容器功率35W， 震蕩頻率42000HZ，震蕩1分種后靜置3分鐘，再震蕩1分種后靜置3分鐘，如此反復重復該過程，直至在體視顯微鏡下觀察到翅羽狀種皮受超聲波能量破壞破裂后再用吸管吸入事先準備好的培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)。結(jié)果如下表
權(quán)利要求
1.一種中國地生蘭花原生細胞胚超聲波破壁培養(yǎng)法，其特征在于它有如下步驟 選用尚未開裂的蘭花果實，表面用75%的酒精滅菌后，取出種子，用10%次氯酸鈉浸泡5^10分鐘，取出再用無菌水沖洗3次完成表面消毒，切開果子，將其中的原生細胞胚粉粒倒入無菌水中，在旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)，促其與水親和，然后倒入消毒無菌的超聲波震蕩容器中， 反復震蕩，直至顯微鏡下觀察到翅羽狀種皮受超聲波破裂后，用吸管吸入事先準備好的培養(yǎng)基中進行無菌培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚超聲波破壁培養(yǎng)法，其特征在于上旋轉(zhuǎn)搖床前，按每IOOml無菌水中滴入0. 5ml表面活性劑吐溫80。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚超聲波破壁培養(yǎng)法，其特征在于震蕩方式是震蕩1分種后靜置3分鐘，再震蕩1分種后靜置3分鐘，如此反復重復該過程。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚超聲波破壁培養(yǎng)法，其特征在于震蕩容器震蕩頻率為42000HZ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細胞胚超聲波破壁培養(yǎng)法，其特征在于切開果子的操作在無菌操作臺上進行。
全文摘要
本發(fā)明是中國地生蘭花原生細胞胚超聲波破壁培養(yǎng)法，步驟是將尚未開裂的蘭花果實用75%的酒精滅菌取出種子，用10%次氯酸鈉浸泡5~10分鐘，取出再用無菌水沖洗3次完成表面消毒，在無菌操作臺上切開果子，將原生細胞胚粉粒倒入無菌水中，在旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)，促其與水親和，倒入消毒無菌的超聲波震蕩容器中反復震蕩直至在體視顯微鏡下觀察到翅羽狀種皮受超聲波能量破壞破裂后，用吸管吸入事先準備好的培養(yǎng)基中進行無菌培養(yǎng)。震蕩方式是震蕩1分種后靜置3分鐘，再震蕩1分種后靜置3分鐘，如此反復重復該過程。本發(fā)明能成功啟動春蘭，寒蘭，綠蘭，秋枝，墨蘭，劍葉蘭等中國地生蘭花原生細胞胚分化發(fā)芽，培養(yǎng)成完整的植株。對于實現(xiàn)稀貴蘭花人工育種栽培，挽救瀕危物種具有重大意義。
文檔編號A01H4/00GK102379242SQ201110249958
公開日2012年3月21日 申請日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月29日
發(fā)明者張笑逸 申請人:張笑逸