專利名稱：一種利用轉(zhuǎn)大豆gtpchi和adcs基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法。
背景技術(shù)：
葉酸(folates)是四氫葉酸(THF)及其衍生物的總稱，是一類水溶性B族維生素，又稱為維生素B9、維生素BI I、維生素M，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖12所示。其中，THF由三部分組成一個(gè)喋啶環(huán)(2-氨基-4-羥基-6-甲基喋啶)，對(duì)氨基苯·甲酸pABA，和多聚谷氨酸(poly-Glu)(l-8fGluX連接)，又名喋酰谷氨酸。不同氧化狀態(tài)的一碳單位，例如甲基，亞甲基，次亞甲基，甲?；B接到喋啶環(huán)的N5、pABA的NlO或橋連兩者從而形成四氫葉酸(THF)、5_甲基THF、5-甲酰THF、5，10-亞甲基THF多種葉酸衍生物。THF及其衍生物作為一碳單位的供體和受體，是介導(dǎo)一碳單位轉(zhuǎn)移反應(yīng)的重要因素。植物和微生物可以從頭合成葉酸從而滿足自身需求，而人類及動(dòng)物則不能合成葉酸，只能通過(guò)飲食來(lái)獲取。食用植物中除菠菜、豆類和椰菜等其葉酸的含量相對(duì)較高外，其他食物如糧食作物、蔬菜水果等的葉酸含量都很低，遠(yuǎn)不能滿足人體對(duì)葉酸的需求量。一般正常人葉酸的需要量為200 400 μ g/d，世界衛(wèi)生組織建議成人至少為200 μ g/d，孕婦和乳母為400 μ g/d。葉酸是維持生物體正常生命過(guò)程所必需的一類有機(jī)物質(zhì)，它對(duì)人體的重要營(yíng)養(yǎng)作用早在1948年即已得到證實(shí)。人類(或其他動(dòng)物)如缺乏葉酸可引起巨紅細(xì)胞性貧血以及白細(xì)胞減少癥，并會(huì)增加心血管疾病及癌癥的發(fā)病率；葉酸對(duì)孕婦尤為重要，如在懷孕頭3個(gè)月內(nèi)缺乏葉酸，可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷，從而增加脊柱裂、無(wú)腦畸形的發(fā)生率，在懷孕的前6周內(nèi)若葉酸攝入不足，嬰兒患無(wú)腦及脊柱裂畸形的可能性會(huì)增加4倍，其次，孕婦經(jīng)常補(bǔ)充葉酸，可防止新生兒體重過(guò)輕、早產(chǎn)以及嬰兒腭裂(兔唇)等先天性畸形；葉酸與維生素B12共同促進(jìn)紅細(xì)胞的生成和成熟，是制造紅血球不可缺少的物質(zhì)；而且葉酸在體內(nèi)參與DNA、氨基酸、泛酸等的合成；葉酸可提供大量游離碳離子，供給制造神經(jīng)末稍和構(gòu)成傳遞神經(jīng)沖動(dòng)的重要化學(xué)物質(zhì)原料，來(lái)保證人體神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。臨床上還發(fā)現(xiàn)葉酸具有抗腫瘤、促進(jìn)嬰幼兒的神經(jīng)細(xì)胞與腦細(xì)胞發(fā)育及輔助治療精神分裂癥等作用。葉酸缺乏的現(xiàn)象在全球普遍存在，尤其在經(jīng)濟(jì)水平和生活水平較低的發(fā)展中國(guó)家和不發(fā)達(dá)國(guó)家。據(jù)調(diào)查顯示，在發(fā)展中國(guó)家每年因葉酸缺乏而導(dǎo)致的嬰兒出生缺陷至少有20萬(wàn)例，因葉酸缺乏而引起孕婦貧血的病例至少有1000萬(wàn)。目前美國(guó)和一些西方國(guó)家采取在食品中添加人工合成葉酸制劑的政策來(lái)滿足人類需求，而這很難在食品加工業(yè)系統(tǒng)不健全、人口分布不平衡、經(jīng)濟(jì)條件有限的發(fā)展中國(guó)家實(shí)行，同時(shí)長(zhǎng)期服用人工合成的葉酸是否會(huì)對(duì)人體帶來(lái)不良副作用也很令人擔(dān)憂。隨著生物技術(shù)的日益發(fā)展，通過(guò)基因工程的手段改造葉酸合成代謝途徑來(lái)提高食物中葉酸含量具有很大的吸引力和極其重要的意義。
植物體內(nèi)葉酸的生物合成已經(jīng)研究的較為清楚，合成部位涉及到3個(gè)不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即質(zhì)體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)，分為三個(gè)分支，其分支圖如圖13所示。其中，蝶呤部分是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以GTP為前體合成，對(duì)氨基苯甲酸的合成是以分支酸為前體在質(zhì)體內(nèi)合成，蝶呤和對(duì)氨基酸甲酸運(yùn)輸?shù)骄€粒體參與合成葉酸。在此過(guò)程中，有兩個(gè)關(guān)鍵酶，包括在蝶呤分支中，第一步反應(yīng)中的GTP環(huán)化酶I (GTP cyclohydrolase I，GTPCHI)，能夠催化GTP形成二氫新蝶呤三磷酸(DHNTP)，以及在pABA合成途徑的第一步反應(yīng)中的氨基脫氧分支酸合成酶(ADCS)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)這兩種葉酸關(guān)鍵酶在植物中的共表達(dá)可以有效提高植物中的葉酸含量。Rocio I等(2007)在研究中發(fā)現(xiàn)擬南芥GTPCHI過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄中，葉酸含量高的果實(shí)中對(duì)氨基苯甲酸消耗殆盡，所以得出適當(dāng)提高蝶呤的合成可增加組織中葉酸的含量。PABA的不足使得葉酸含量?jī)H提高了 2倍，推測(cè)在轉(zhuǎn)GTPCHI基因的植株中補(bǔ)充PABA則能進(jìn)一步提高葉酸含量。之后，他們將過(guò)量表達(dá)PABA和過(guò) 量表達(dá)蝶呤的植株雜交，使這兩個(gè)性狀結(jié)合后，其成熟果實(shí)中葉酸含量提高了約25倍。這說(shuō)明在番茄中GTPCHI和ADCS的共同作用對(duì)葉酸的合成很重要。大豆中葉酸的含量較高，大豆的GTPCHI和ADCS對(duì)葉酸的合成是否存在協(xié)同增效還沒有報(bào)道。將大豆的GTPCHI和ADCS共表達(dá)，為進(jìn)行作物蔬菜等的轉(zhuǎn)化，提高糧食作物蔬菜中葉酸的含量，從而滿足人類的日常需求，降低新生兒的出生缺陷，增強(qiáng)抵抗力，預(yù)防心血管疾病、癌癥的發(fā)生等具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法。根據(jù)本發(fā)明的一種利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，包括將上述兩種大豆基因=GmGTPCHI基因和GmADCS基因轉(zhuǎn)入植物并共表達(dá)的步驟，其中，大豆GmGTPCHI基因的⑶S序列如SEQ ID No. I所示，大豆GmADCS基因的⑶S序列如SEQ ID No. 2所示。根據(jù)本發(fā)明的利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其中，將大豆GTPCHI和ADCS基因共表達(dá)的方法如下方法(I)分別構(gòu)建大豆GTPCHI和ADCS基因的表達(dá)載體，然后導(dǎo)入目的植物中，共表達(dá)；或方法(2)構(gòu)建大豆GTPCHI和ADCS基因串聯(lián)的共表達(dá)載體，然后導(dǎo)入目的植物中，共表達(dá)。具體地，對(duì)于方法(I)，可以將大豆的GmGTPCHI和GmADCS基因的⑶S分別構(gòu)建到植物過(guò)表達(dá)載體，并分別侵染到植物中，其中，選用GmGTPCHI侵染的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株做父本，GmADCS侵染的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株做母本，進(jìn)行雜交得到獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因雜交植株中目的基因的表達(dá)水平，并測(cè)定這些植株中的葉酸含量，結(jié)果表明，比GmGTPCHI和GmADCS單獨(dú)侵染的植株均有明顯提高，比野生型提高了 2. 5 4. 5倍。或者，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于方法(2)，可以將大豆GmGTPCHI和GmADCS分別由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，串聯(lián)到pCAMBIA3301載體上，侵染植物，將收獲的種子在抗性培養(yǎng)基上篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植株。用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因植物中目的基因的表達(dá)水平，并測(cè)定這些植株中的葉酸含量，發(fā)現(xiàn)比GmGTPCHI和GmADCS單獨(dú)侵染的植株均有明顯提高，比野生型提高了 3 4. 5倍。因此，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，將大豆的葉酸合成關(guān)鍵酶GTPCHI和ADCS在其它植物中共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)酶共同作用可顯著提高擬南芥的葉酸含量，這為進(jìn)行作物蔬菜水果等的轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，人類可通過(guò)飲食直接獲得天然的葉酸，解決葉酸攝入缺乏的現(xiàn)象，并克服了長(zhǎng)期服用葉酸片劑帶來(lái)的不良副作用。
圖I為雜交陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的基因型鑒定。所示為PCR擴(kuò)增的部分電泳圖，其中
4、5、6、7、8、10、11 為轉(zhuǎn)入 GmGTPCHI 基因的植株，1、2 、4、5、6、7、8、9、11、12 為轉(zhuǎn)入 GmADCS 基因的植株。圖2為雜交陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株中GmGTPCHI、GmADCS表達(dá)水平檢測(cè)。野生型擬南芥(WT)為陰性對(duì)照，在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中均檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，表達(dá)量在不同植株中存
在差異。圖3為雜交植株葉酸含量分析。WT野生型為對(duì)照，GTPCHI為單獨(dú)轉(zhuǎn)入GmGTPCHI的植株，ADCS為單獨(dú)轉(zhuǎn)入GmADCS的植株，GA1-GA6為雜交株系。圖4為GmGTPCHI和GmADCS同時(shí)克隆到pCAMBIA1301的載體圖示。圖5為串聯(lián)載體侵染野生型擬南芥植株基因型鑒定。其中Cl、C2、C4、C6、C7、C8為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。圖6為串聯(lián)載體陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株基因GmGTPCHI、GmADCS表達(dá)水平分析。野生型擬南芥(WT)為陰性對(duì)照，在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中均檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，且表達(dá)量在不同植株中存在差異。圖7為串聯(lián)載體陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株葉酸含量分析。圖8為轉(zhuǎn)GmGTPCHI基因植株基因型鑒定，1-13為GmGTPCHI侵染后的擬南芥植株，1、3、5-11、13為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。圖9為轉(zhuǎn)GmGTPCHI基因植株葉酸含量的測(cè)定結(jié)果，具體地，是測(cè)定兩種主要的葉酸存在形式5-甲基THF和5-甲酰THF的含量之和。圖10為轉(zhuǎn)基因植株基因型的鑒定，其中1_4、6、7、10-12為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。圖11為轉(zhuǎn)基因植株中pABA含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株pABA含量比野生型有所提聞。
圖12為葉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖13為植物體內(nèi)葉酸的生物合成分支圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)施例I、GmGTPCHI基因的克隆及表達(dá)I、獲得大豆GTPCHI基因的EST序列
由于來(lái)源于不同物種的GTPCHI基因應(yīng)該具有一定程度的同源性，或存在保守的結(jié)構(gòu)域。為此，將擬南芥的GTPCHI基因的⑶S序列與大豆的EST序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，獲得大豆GTPCHI基因的EST序列。2、PCR擴(kuò)增得到GmGTPCHI基因片段及其序列分析取大豆葉片lOOmg，采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)DNase I處理后，檢測(cè)RNA純度和濃度，取I U g用反轉(zhuǎn)錄試劑盒First strand cDNA systhesis (購(gòu)自Fermentas)獲得cDNA。以大豆GTPCHI基因的EST序列為模板設(shè)計(jì)引物，以大豆cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。獲得約700bp條帶，測(cè)序?yàn)榇蠖笹TPCHI的片段序列，分別將序列與5’端的EST和3’端EST序列在Vector NTI中進(jìn)行組裝拼接。以GTPCHI-3FW、GTPCHI_7RV為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見表1)，得到1400bp左右的產(chǎn)物，將這些片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收，分別連到P-EASY-Tl載體(購(gòu)自全式金公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選和菌落PCR獲得陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序分析，得到1380bp目的片段，命名為GmGTPCHI。3、5’和3’ RACE獲得GmGTPCHI基因的全長(zhǎng) 以上述得到的序列GmGTPCHI為模板，分別設(shè)計(jì)5’ RACE和3’ RACE引物，分別命名為GmGTPCHI5’RACE，GmGTPCHI5’RACE nest,GmGTPCHI3JRACE,GmGTPCHI3JRACE nest (引物序列見表I)。采用Trizol法提取大豆葉片總RNA,根據(jù)geneRACE試劑盒(購(gòu)自invitrogen)的說(shuō)明書上的方法得到5’和3’ RACE的cDNA，以5’和3’ RACE的cDNA為模板，用上述的5’ RACE和3’ RACE引物，分別進(jìn)行巢式PCR。將PCR獲得條帶回收并連接p_EASY_Tl載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與網(wǎng)站公布的GmGTPCHI UTR序列一致。經(jīng)序列分析得到大豆葉酸關(guān)鍵酶基因GmGTPCHI完整的CDS序列1380bp。表I大豆GTPCHI基因克隆引物序列
一引物名稱序列5’-3’
GTPCHI3-FWATGGAGCATTTGGGTCAGTATG
GTPCHI7RVTCAAAGAGATGTAGCATTTGG
GmGTPCHIS5RACECCTTCGC ACTTTGCTTGTAACCTC
GmGTPCHIS5RACE nest GTGGTGTCTTTATAATGCCTTCCCTG GmGTPCHD 5RACEGTGATAGTGGTGGTGGAAGC AAGTC
GmGTPCHD ;RACE nest GACCTTGCTGCAAGAACCTCGTTTC4、轉(zhuǎn)GmGTPCHI基因擬南芥葉酸含量的鑒定將大豆的GmGTPCHI的⑶S序列構(gòu)建到植物表達(dá)載體pH2GW7上，由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，得到重組載體pH2GW7-GmGTPCHI。將載體電擊轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌LBA4404，挑取酶切鑒定正確的克隆，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花沾法侵染野生型擬南芥，收獲的種子記為Ttl代。Ttl代種子首先在1/2MS+潮霉素B (25mg/L)的抗性培養(yǎng)基上篩選，獲得13株陽(yáng)性綠苗(記為T1代)，并移入溫室中培養(yǎng)20天，分別取葉片提取DNA，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株，其中1、3、5-11、13為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株(如圖8所示)。利用高效液相色譜測(cè)定法檢測(cè)這些轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中的葉酸含量，主要是檢測(cè)5-甲基THF和5-甲酰THF這兩種主要的葉酸衍生物含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GmGTPCHI轉(zhuǎn)基因植株比野生型提高了 I. 6 2倍(如圖9所示)O
實(shí)施例2、GmADCS基因的克隆及表達(dá)I、獲得大豆ADCS基因的EST序列將擬南芥的ADCS基因的⑶S序列與大豆的EST序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，獲得大豆GTPCHI基因的EST序列。2、PCR擴(kuò)增得到GmADCS基因片段及其序列分析取大豆葉片lOOmg，采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)DNase I處理后，檢測(cè)RNA純度和濃度，取I U g用反轉(zhuǎn)錄試劑盒First strand cDNA systhesis (購(gòu)自Fermentas)獲得cDNA。以大豆ADCS基因的EST序列為模板設(shè)計(jì)引物，以大豆cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。獲得約1300bp條帶，片段回收后連p-EASY-Tl載體，挑取8個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，與3’EST進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果一致且與3’ EST匹配，大小為1352bp。將獲得的1352bp序列與已經(jīng)公布的大豆基因組序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與大豆10號(hào)染色體的一段序列一致性很高，且其預(yù)測(cè)的⑶S序列2304bp，根據(jù)預(yù)測(cè)的⑶S序列設(shè)計(jì)引物ADCSMF和ADCSMR(引物序列見·表2)，PCR擴(kuò)增得到GmADCS基因的大部分⑶S序列2296bp。3、5’和3’ RACE獲得GmADCS基因的全長(zhǎng)Trizol法提取大豆葉片提取總RNA,經(jīng)DNase I處理后，取5 μ g,根據(jù)geneRACE試劑盒(購(gòu)自invitrogen)的方法獲得cDNA。根據(jù)已獲得序列5’端260bp處設(shè)計(jì)引物ADCS5’RACE，180bp處設(shè)計(jì)引物ADCS5, RACE nest (引物序列見表2)。之后做巢式PCR。電泳檢測(cè)得到SOObp左右的片段，片段回收后連p-EASY-Tl載體，經(jīng)測(cè)序分析，在已知序列的基礎(chǔ)上獲得483bp的5’端序列和218bp5’ UTR序列。根據(jù)已獲得序列3’末端300bp處設(shè)計(jì)引物ADCS 3’RACE，159bp處設(shè)計(jì)引物ADCS 3’RACEnest (引物序列見表2)。之后做巢式PCR，電泳檢測(cè)得到400bp左右的片段，片段回收后連p-EASY-Tl載體，經(jīng)測(cè)序分析，獲得252bp大豆的3’UTR序列。將獲得的序列進(jìn)行拼接，經(jīng)分析最終得到完整的GmADCS基因序列，根據(jù)克隆得到的序列設(shè)計(jì)克隆GmADCS基因CDS全長(zhǎng)的引物ADCSIOFLFI和ADCSIORI (弓丨物序列見表2)，PCR并對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，得到⑶S序列2784bp。表2GmADCS基因克隆引物序列
"引物名稱序列5’-3’
ADCSMF GCATTTGTCTTCAGCTGTTG ADCSMR CTAAGC AAAATGCATCACAG ADCS5，RACE CCTCTGTGTCATTC AACC ACTGTG ADCS5，RACE nest GACGGTTCGATTTCACACCACACTC ADCS 3，RACE CCTGGTGGTTCAATGACAGGTGCAC ADCS 3 5RACE nest CAGTCATTGTACACGAGGGTGAAG ADCS IOFLFI ATGAATTCGTCTCTGCGTTTG ADCS10R1_CTAAGC AAAATGCATCACAGC_4、轉(zhuǎn)GmADCS基因擬南芥的獲得及其葉酸合成前體pABA含量的測(cè)定將GmADCS的⑶S序列構(gòu)建到植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1302的酶切位點(diǎn)Nco I和Pml I之間，由花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)得到重組表達(dá)載體pCAMBIA1302-GmADCS。將上述重組載體電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，挑取酶切鑒定正確的克隆，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花沾法侵染野生型擬南芥，收獲的種子記為Ttl代。Ttl代種子首先在1/2MS+潮霉素B (25mg/L)的抗性培養(yǎng)基上篩選，獲得13株陽(yáng)性綠苗(記為T1代)，并移入溫室中培養(yǎng)20天，分別取葉片提取DNA，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株，侵染的植株中1-4、6.、7、10-12為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(如圖10所示)。利用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中的葉酸合成前體pABA含量，發(fā)現(xiàn)比野生型提高I. 2 2倍(如圖11)。實(shí)施例3、雙基因雜交植株的獲得及其葉酸含量的測(cè)定將大豆的GmGTPCHI和GmADCS的⑶S序列分別構(gòu)建到植物過(guò)表達(dá)載體，均由花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。其中，大豆GmGTPCHI的⑶S序列通過(guò)Gateway系統(tǒng)重組到PH2GW7，大豆葉酸合成關(guān)鍵酶基因GmADCS的⑶S序列構(gòu)建到植物過(guò)表達(dá)載體PCAMBIA1302的酶切位點(diǎn)Nco I和Pml I之間，得到重組表達(dá)載體pCAMBIA1302_GmADCS。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花沾法侵染野生型擬南芥。將獲得的轉(zhuǎn)入GmGTPCHI的Ttl代陽(yáng)性擬南芥植株GI-G4做父本，將獲得的轉(zhuǎn)入GmADCS的TO代陽(yáng)性擬南芥植株A1-5做母本，進(jìn)行了如下的雜交組合Glx Al，GlxA2, G2xA3, G2xA4，G3xA2，G4xA5，雜交后的種莢分別單獨(dú)收獲(見表3)。種子在溫室中培養(yǎng)20天，分別取葉片提取DNA。設(shè)計(jì)GmGTPCHI和GmADCS基因特異引物(表4)，以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下
IOxTaq buffer2ul
dNTPs (2.5mM each) 2ul 引物 Fw (IOuM)Iul
引物 Rv (IOuM)Iul
DNA 模板(10ng/ul) 2ul Taq 酶(5U/ul)0.2ul
ddH20補(bǔ)足至 20ulPCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，Taq酶72°C擴(kuò)增30s，35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物I %瓊脂糖電泳檢測(cè)，得到400bp左右的片段為目的條帶。圖I所示為PCR擴(kuò)增的部分電泳圖，其中4、5、6、7、8、10、11為轉(zhuǎn)入GmGTPCHI基因的植株，1、2、4、
5、6、7、8、9、11、12為轉(zhuǎn)入GmADCS基因的植株，因此，4、5、6、7、8、11為同時(shí)轉(zhuǎn)入兩個(gè)目的基因的植株。進(jìn)一步用RNA Trizol法提取了上述同時(shí)轉(zhuǎn)入兩個(gè)目的基因植株的總RNA，經(jīng)DNase I處理后,取I μ g，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)的方法獲得cDNA作模板,用表4中所示的基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)GmGTPCHI和GmADCS的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)野生型里均檢測(cè)不到兩個(gè)基因的表達(dá)，而轉(zhuǎn)基因植株中可檢測(cè)到基因的顯著表達(dá)，且不同株系間基因的表達(dá)存在差異，圖2為部分檢測(cè)的電泳圖。分別把641、642、643、644、645、6八6的后代中鑒定為雙基因轉(zhuǎn)入的植株取生長(zhǎng)30天的葉片，提取葉酸，用高效液相色譜法分析葉酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型相比，單獨(dú)轉(zhuǎn)入GmGTPCHI的葉酸含量提高了 I. 5倍，單獨(dú)轉(zhuǎn)入GmADCS的植株葉酸含量沒有變化，雜交植株葉酸含量比野生型提高了 2. 5 4. 5倍(圖3)。
表3進(jìn)行雜交獲得的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系。
權(quán)利要求
1.一種利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括將含有大豆GTPCHI和ADCS基因的過(guò)表達(dá)載體共同導(dǎo)入目的植物中、通過(guò)兩種基因的共表達(dá)提高植物的葉酸含量的步驟， 其中，所述GTPCHI基因的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；所述ADCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，將大豆GTPCHI和ADCS基因共表達(dá)的方法如下 方法⑴分別構(gòu)建大豆GTPCHI和ADCS基因的表達(dá)載體，然后導(dǎo)入目的植物中，共表達(dá)；或 方法(2)構(gòu)建大豆GTPCHI和ADCS基因串聯(lián)的共表達(dá)載體，然后導(dǎo)入目的植物中，共表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，對(duì)于方法(I)，將大豆GTPCHI和ADCS基因分別構(gòu)建植物表達(dá)載體并分別轉(zhuǎn)染到不同植株中，選用大豆GTPCHI基因侵染的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株做父本，選用大豆ADCS基因侵染的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株做母本，將父本與母本進(jìn)行雜交獲得雙基因雜交植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法，其特征在于，對(duì)于方法(2)，將大豆GTPCHI和ADCS基因串聯(lián)在表達(dá)載體PCAMBIA1301載體上，將載體轉(zhuǎn)染到植株，將收獲的種子在抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及利用轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用提高植物葉酸含量的方法。根據(jù)本發(fā)明的大豆葉酸合成關(guān)鍵酶GTPCHI基因序列如SEQ ID No.1所示，ADCS基因序列如SEQ ID No.2所示。轉(zhuǎn)大豆GTPCHI和ADCS基因協(xié)同增效作用能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因植株中葉酸的含量，因此，本發(fā)明可以作為一種生產(chǎn)高含量葉酸轉(zhuǎn)基因植物的方法，人類可通過(guò)飲食這類植物直接獲得天然的葉酸，解決葉酸攝入缺乏的現(xiàn)象，并克服了長(zhǎng)期服用葉酸片劑帶來(lái)的不良副作用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102899349SQ20111021651
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者張春義, 梁秋菊, 范云六 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所