hHscFv-Rcr基因序列及轉(zhuǎn)基因煙草的制備方法

專利名稱：hHscFv-Rcr基因序列及轉(zhuǎn)基因煙草的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程領(lǐng)域的植物基因序列及轉(zhuǎn)基因的方法，具體涉及一種 hHscFv-Rcr基因序列及轉(zhuǎn)基因煙草的制備方法。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌(h印atocellular carcinoma,HCC)惡性程度極高，發(fā)病隱匿、轉(zhuǎn)移早、死 亡率高，嚴(yán)重地危害人類健康，在眾多致死性腫瘤中居第4位，在我國居于第2位。傳統(tǒng)的手 術(shù)和放、化療方法治療肝癌有易復(fù)發(fā)、殺傷腫瘤細(xì)胞靶向性差的缺陷；抗體是目前腫瘤治療 中靶標(biāo)最明確的特異靶向藥物。不過完整抗體存在分子量大(難以進(jìn)入腫瘤組織)、有免疫 原性(目前抗體多為鼠源)、用量大和價(jià)格昂貴等缺陷，臨床應(yīng)用受限。因而，小分子量、人 源化的單鏈抗體是目前腫瘤靶向治療的主要趨勢(shì)，基因工程技術(shù)為人源化單鏈抗體的設(shè)計(jì) 和生產(chǎn)提供了可能。同時(shí)，牛蛙核糖核酸酶(Rana catesbeiana RNase, Rcr)分子量小、細(xì) 胞毒性強(qiáng)，是臨床惡性腫瘤治療常用的細(xì)胞毒素。目前臨床用Rcr主要通過組織提取法獲 得，因受組織來源和Rcr含量限制，限制了 Rcr臨床應(yīng)用(廖有地等，蛋白表達(dá)和純，1996， 7(2) :194-202)。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn) Rcr已成為可能，為Rcr生產(chǎn)和緩解或解決臨床供不應(yīng)求問題提供了一種新思路。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，雖然利用基因工程技術(shù)在人源化抗肝細(xì)胞癌單 nj^gjjxf^ (human-originate hepatocellular carcinoma single chain variable
fragments, hHscFv)表達(dá)研究取得了 一些進(jìn)展，如付勇等(生物技術(shù)通訊，2003，14 (5) 353-356)、袁清安等(生物工程學(xué)報(bào)，2000，16(1) :86-90)和張靜等(世界胃腸病學(xué)雜志， 2004,10(13) :1872-1875)利用原核系統(tǒng)(大腸桿菌)成功地表達(dá)了人源化抗肝細(xì)胞癌單 鏈可變區(qū)抗體。付勇等(腫瘤研究與臨床，2004，16 ) =217-220)利用原核系統(tǒng)(大腸桿 菌)成功地表達(dá)了 Rcr，不過包括細(xì)菌在內(nèi)的原核表達(dá)系統(tǒng)與某些真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母、動(dòng) 物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與高等植物表達(dá)系統(tǒng)相比，在安全性、生產(chǎn)成本和規(guī)模化生產(chǎn)方面存 在明顯缺陷(Fischer等.轉(zhuǎn)基因研究，2000，9 :279-299 ；Ma等.自然遺傳學(xué)綜述，2003，4 794-805)，目前尚未見有按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成融合基因hHscFv-Rcr，在植物中表達(dá) hHscFv-Rcr的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種hHscFv-Rcr基因序列及轉(zhuǎn) 基因煙草的制備方法，通過構(gòu)建植物表達(dá)載體，在植物中表達(dá)hHscFv-Rcr活性多肽，產(chǎn)品 對(duì)防止和治療肝癌方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種hHscFv-Rcr氨基酸序列，具體如SEQ ID N0. 2所示。本發(fā)明涉及一種hHscFv-Rcr核苷酸序列，具體如SEQ ID NO. 1中第56-1258位所不。
在本發(fā)明提供的在植物中表達(dá)的hHscFv，它包括具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列 的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO. 2序列的多肽。在本發(fā)明的幾種表達(dá)載體，它包含上述的DNA分子。本發(fā)明涉及一種利用植物系統(tǒng)表達(dá)上述hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，該方法包 括如下的步驟第一步、含hHscFv-Rcr表達(dá)載體的構(gòu)建將含有融合基因hHscFv-Rcr的克隆載體 質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收目標(biāo)DNA片段，獲得帶有相應(yīng)的粘性末端的目的基因hHscFv-Rcr，然后 將其克隆到植物表達(dá)載體中，通過測(cè)序或酶切鑒定，在確保表達(dá)載體中的目的基因閱讀框 架正確的前提下，再將表達(dá)載體質(zhì)粒用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，獲得包含目的基因表達(dá)載體 的工程菌；第二步、植物遺傳轉(zhuǎn)化，具體步驟為2. 1)將滅菌后的煙草種子播于發(fā)苗培養(yǎng)基上，取生長兩周左右的無菌葉片，作為 外植體用于轉(zhuǎn)化；2. 2)將滅菌后的植物(如煙草，不僅限于煙草)種子播于發(fā)苗培養(yǎng)基上，取生長兩 周左右的煙草的無菌葉片，作為外植體用于轉(zhuǎn)化；2. 3)將含有目的基因表達(dá)載體的工程菌(攜帶植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌)于 28°C搖菌培養(yǎng)至OD600 = 0 . 8 1. 0時(shí)，室溫6，OOOrpm離心5 8分鐘；2. 4)棄上清，菌體用液體MS培養(yǎng)基重懸，然后加入準(zhǔn)備好的外植體浸泡8 10分 鐘；2. 5)將浸染結(jié)束后的外植體取出，吸去表面殘余菌液；然后將外植體置于共培養(yǎng) 培養(yǎng)基上在25°C共培養(yǎng)36小時(shí)；2. 6)共培養(yǎng)結(jié)束后將外植體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，在25 光照下培養(yǎng)，培養(yǎng) 7 15天可見愈傷組織的形成，約20天后可見分化芽長出；2. 7)待再生芽長至約3-4厘米時(shí)，將其切下移植到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)， 7 10天左右生根；2. 8)形成完整根系后，將植株取出，用自來水洗去附著在根系上的固體培養(yǎng)基，在 珍珠巖中馴化并用質(zhì)量體積百分比為的MS粉水溶液補(bǔ)充營養(yǎng)和水分，一周后移入土 中。第三步、hHscFv-Rcr功能蛋白提取3. 1)取5g轉(zhuǎn)基因煙草葉片，在加有液氮的研缽中研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)移至50mL 聚丙烯離心管中，并加入 5mL IXPBS (KH2PO4 0. 2g/L, Na2HPO4 1. 15g/L, KCl 0. 2g/L, NaCl 8g/L)；3. 2) 13000rpm 4°C離心 30 分鐘；3. 3)收集上清于另一新離心管中備用。3.4)蛋白定量參考 Bradford 法(Bradford，1976)，取 2μ L 蛋白樣品加 98μ L Bradford試劑混勻后，在酶標(biāo)儀下(Bio-TEK，USA)測(cè)OD595的吸光值。所述的工程菌是指攜帶煙草表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌；所述發(fā)苗培養(yǎng)基的各組成成分的質(zhì)量百分比為MS粉為0. 22%，蔗糖為3%，植物凝膠為0.沈％，余量為蒸餾水；該發(fā)苗培養(yǎng)基的PH值為5. 8。所述液體MS培養(yǎng)基的各組成成分的質(zhì)量百分比為MS粉為0. 44%，蔗糖為3%， 余量為蒸餾水。該液體MS培養(yǎng)基的pH值為5. 8。所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的各組成成分的質(zhì)量百分比為MS粉為0. 44%，蔗糖為3%，植 物凝膠為0.，6-芐氨基嘌呤為0. 0001 %，α -萘乙酸為0. 00001%，余量為蒸餾水。該 共培養(yǎng)培養(yǎng)基的PH值為5.8。所述分化培養(yǎng)基的各組成成分的質(zhì)量百分比為MS粉為0. 44%，蔗糖為3%，植物 凝膠為0.沈％，6-芐氨基嘌呤為0. 0001 %，α -萘乙酸為0. 00001%，卡那霉素為0. 005 %， 羧芐青霉素為0. 025%，余量為蒸餾水。該分化培養(yǎng)基的pH值為5. 8。所述生根培養(yǎng)基的各組成成分的質(zhì)量百分比為MS粉為0. 44%，蔗糖為3%，植物 凝膠為0.沈％，6-芐氨基嘌呤為0. 0001 %，α -萘乙酸為0. 00001%，卡那霉素為0. 005 %， 羧芐青霉素為0. 025%，余量為蒸餾水。該生根培養(yǎng)基的pH值為5. 8。本發(fā)明開辟了 hHscFv-Rcr蛋白生產(chǎn)的新途徑，本發(fā)明的方法按植物偏愛密碼子 設(shè)計(jì)人工合成的hHscFv-Rcr在植物系統(tǒng)表達(dá)其活性的生物產(chǎn)品對(duì)治療癌癥方面具有重大 作用及應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)、分析DNA樣品中是否存在hHscFv-Rcr基因， 蛋白樣品中是否含有hHscFv-Rcr蛋白的研究方法，并對(duì)所述的蛋白生物活性和功能進(jìn)行 了初步研究，為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。


圖1轉(zhuǎn)基因煙草聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)結(jié)果圖；其中泳道M為DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道P為含表達(dá)載體質(zhì)粒 p35S: hHscFv-Rcr (pCAMBIA2300骨架)的農(nóng)桿菌EHA105作模板的陽性對(duì)照；泳道N為非 轉(zhuǎn)基因煙草的陰性對(duì)照；其它泳道為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因煙草植株1-13。圖2轉(zhuǎn)基因煙草DNA分子雜交(Southern blot)分析圖；其中左側(cè)的數(shù)字是與酶切的基因組DNA共分離的λ /Hind III的DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)；泳道P為P35S: IhHscFv-Rcr質(zhì)粒作模板的陽性對(duì)照；泳道ck為非轉(zhuǎn)基因煙草植株；其 它泳道為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因煙草植株1-12。圖3用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)hHscFv-Rcr基因在轉(zhuǎn)基因煙 草的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)示意圖；其中左圖表示hHscFv-Rcr基因在轉(zhuǎn)基因煙草株系中表達(dá)；CK為從非轉(zhuǎn)基因煙草 植株葉片中提取RNA ；泳道1至泳道12分別為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因煙草植株1-12 ；Actin基因?yàn)?RNA用量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照；圖中數(shù)字為3次重復(fù)的平均值。圖4轉(zhuǎn)hHscFv-Rcr基因煙草總可溶蛋白免疫印跡(Western blot)分析圖；其中泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道ck為源自非轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總可溶蛋 白；其它泳道源自轉(zhuǎn)基因煙草株系1，2，3，5，6，9，11，12總可溶蛋白；圖左側(cè)的數(shù)據(jù)為蛋白 分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。圖5轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)的hHscFv-Rcr蛋白與不同腫瘤細(xì)胞的結(jié)合親和力曲線其中HL_7702為人正常肝細(xì)胞，HepG2為人肝癌細(xì)胞，DV145為前列腺癌細(xì)胞， SGC-7901為人胃癌細(xì)胞，SPC為人肺癌細(xì)胞。
圖6轉(zhuǎn)基因煙草的hHscFv-Rcr蛋白的腫瘤抑制活性分析(MTT)其中!fepG2和SMMC7721為人肝癌細(xì)胞，DV145為前列腺癌細(xì)胞，HL-7702為人正 常肝細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本實(shí)施例包括以下步驟hHscFv-Rcr基因合成及載體構(gòu)建1.基因合成(gene synthesis)本實(shí)施例的按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成的hHscFv-Rcr基因全長為1272bp (包括 保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)組成的接頭)，詳細(xì)序列見SEQ ID NO. 1 ；合成之后連入pUC57載體，即 pUC57-hHscFv-Rcr。2.酶切(digestion of the restriction enzyme)用Bam H I 及 Sac I 雙切 pUC57_hHscFv-Rcr，獲得帶有 Bam H I 及 Sac I 粘性末 端(與表達(dá)載體相同)的hHscFv-Rcr基因DNA片段；3.連接(ligation)將切下的hHscFv-Rcr基因連入已經(jīng)用Bam H I及Me I切好的用pBI121改造過 的PCAMBIA2300植物雙元表達(dá)載體大片段中，構(gòu)建p35S:: hHscFv-Rcr，用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化 的大腸桿菌，從而獲得陽性克隆。4.基因PCR檢測(cè)植物雙元表達(dá)載體質(zhì)粒p35S hHscFv-Rcr檢測(cè)PCR 擴(kuò)增體系 25μ L，包括弓丨物 hHscFvF(5，-atg gag gtt caa ctt gtt gag_3，) 禾口 RcrR(5，-tatggg cat ctt cca aat tcc agc_3，)各 1 μ L(10 μ mol/L),0. 3 μ L Taq DNA 聚合酶(5units/ μ L)，2· 5 μ L 的 10XPCR 緩沖液，1· 5 μ L 的 Mg Cl2 (25mmol/L)，2 μ L 模板 (待檢菌液)，1. 5 μ L的dNIPs (2. 5mmol/L)，15. 2 μ L去離子無菌水，上覆20 μ L滅菌石蠟 油；PCR 條件:94°C 8min ；94°C 45s，55°C 45s, 72°C Imin (35 循環(huán))；72°C延伸 8min ；電 泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為1208bp。實(shí)施例2hHscFv-Rcr在煙草細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)1.含目的基因(hHscFv-Rcr)表達(dá)載體構(gòu)建用Bam H I和Sac I將含有hHscFv-Rcr基因的克隆載體質(zhì)粒pUC57_hHscFv-Rcr 進(jìn)行酶切，用膠回收試劑盒(華舜生物技術(shù)有限公司，上海)回收目標(biāo)DNA片段，獲 得帶有相應(yīng)的粘性末端的目的基因hHscFv-Rcr，然后將其克隆到植物雙元表達(dá)載體pCA2300-twin (不限于此，也包括如pBI121或改造過的pCAMBIA2300等植物表達(dá)載體)中， 通過測(cè)序或酶切鑒定，在確保表達(dá)載體中的目的基因閱讀框架正確的前提下，再將表達(dá)載 體質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(如EHA105)中，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草。2.煙草遺傳轉(zhuǎn)化①將滅菌后的植物種子播于發(fā)苗培養(yǎng)基上，取生長兩周左右的煙草的無菌葉片， 作為外植體用于轉(zhuǎn)化；②將含有目的基因表達(dá)載體的工程菌于搖菌培養(yǎng)至0D_ = 0. 8 1. 0時(shí)，室 溫6，OOOg離心5 8分鐘；③棄上清，菌體用液體MS培養(yǎng)基重懸，然后加入準(zhǔn)備好的外植體浸泡8 10分 鐘；④將浸染結(jié)束后的外植體取出，吸去表面殘余菌液；然后將外植體置于共培養(yǎng)培 養(yǎng)基上在25°C共培養(yǎng)36小時(shí)；⑤共培養(yǎng)結(jié)束后將外植體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，在25 光照下培養(yǎng)，培養(yǎng) 7 15天可見愈傷組織的形成，約20天后可見分化芽長出；⑥待再生芽長至約3-4厘米時(shí)，將其切下移植到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，7 10天左右生根；⑦根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗去附著在根系上的固體培養(yǎng)基，在珍珠巖 中馴化并用質(zhì)量體積百分比為的MS粉水溶液補(bǔ)充營養(yǎng)和水分，一周后移入土中。3.轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測(cè)①基因組DNA提取用CTAB法提取煙草基因組DNA (Stewart and Via, 1993)，取 50ng煙草基因組DNA作模板進(jìn)行PCR檢測(cè)；②PCR擴(kuò)增體系25μL，包括引物hHscFvF(5’_atg gag gtt caa ctt gtt gag_3，) 禾口 RcrR (5，-tat ggg cat ctt cca aat tcc agc_3，)各 1 μ L (10 μ M/L), 0. 3 μ L Taq DNA 聚合酶(5units/y L)，2· 5μ L 的 10XPCR 緩沖液，1. 5 μ L 的 Mg Cl2 (25mmol/L)，2 μ L 煙草 基因組 DNA 模板(50ng)，1. 5 μ L 的 dNIPs (2. 5mmol/L)，15. 2 μ L 去離子無菌水，上覆 20 μ L 滅菌石蠟油；③PCR 條件94°C 8min ;94°C 45s，55°C 45s，72°C Imin (35 循環(huán))；72°C延伸 8min; 電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為1208bp ；④PCR產(chǎn)物檢測(cè)用帶有EB(ethidium bromide)的1. 0 % (w/v)瓊脂糖膠在 IXTAE電泳緩沖液中電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)紫光下檢測(cè)并拍照；見附圖I。4.轉(zhuǎn)基因煙草Southern blot分析①煙草基因組DNA提取和轉(zhuǎn)膜用CTAB法提取煙草嫩葉基因組DNA(Stewart and Via，1993)，取30 μ g煙草 基因組DNA，用Hin dill酶切，瓊脂糖膠進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到Hybond N+膜上 (Amersham Pharmacia，Uppsala，Sweden)；②探針標(biāo)記、雜交和信號(hào)檢測(cè)以質(zhì)粒p35S: IhHscFv-Rcr為模版擴(kuò)增得到含hHscFv-Rcr基因DNA片段，用于探 針標(biāo)記；探針標(biāo)記、雜交和信號(hào)檢測(cè)使用Gene Images Random Primer Labeling method和 CDP-Stardetection module試劑盒(Amersham Pharmacia)，按生產(chǎn)廠家操作說明書指導(dǎo)進(jìn)行。在62°C雜交12小時(shí)后，用洗膜液1(1 XSSC和0. 1% SDQ在62°C下洗雜交膜2次(各 15分鐘)，然后用洗膜液II(0.5XSSC和0. 1% SDS)在62°C下洗雜交膜1次(15分鐘)； 滴加顯色液后將雜交膜置于富士 X-光片上暴光2-3小時(shí)檢測(cè)雜交信號(hào)；見附圖II。5.用RT-PCR檢測(cè)hHscFv-Rcr在轉(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)錄①RNA提取按植物抽提試劑盒(天根生化科技有限公司，上海)廠家說明抽提煙 草葉片總RNA ；RNA模板預(yù)先用DNase I (RNase-free, TaKaRa)處理以去除來自于煙草基因 組DNA的污染；②RT-PCR 體系用 one-step RT-PCR 試劑盒(TaKaRa，Japan)進(jìn)行 RT-PCR 分析；RT-PCR擴(kuò)增體系為50 μ L，包括5μ L的10 X One-st印RNA PCR緩沖液， 10 μ L 的 MgC12(25mM)，5μ L 的 dNTPs (IOmM)，1 μ L 的 RNase Inhibitor (40U/μ L)， IyL 的 AMV-Optimized Taq (5U/μ L) , 1 μ L 的 AMV-RTase XL(5U/y L) , HFl (RT) (5，-aggacttgttcaaccaggag-3，) (10 μ Μ)禾口 HRl(RT) :(5，_tccaatagcagaaacccac_3，) (10 μ Μ)各 1 μ L，1 μ L 的 Total RNA (1 μ g/ μ L)，24 μ L 的 RNase Free water ；③RT-PCR擴(kuò)增條件RNA模板在50°C條件下逆轉(zhuǎn)錄30min ；95°C變性2min，隨后 95°C變性45s，52°C退火45s and 72°C延伸Imin ( 個(gè)循環(huán))；最后72°C再延伸Snin。④管家基因(Actin) RT-PCR檢測(cè)作為Actin內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR檢測(cè)引物為Act-F 1 (5，-ggtagctcccacctgagaggaagt_3，)和 Act-Rl (5，_gcctttgcaatccacatatgc_3')；反應(yīng) 體系和反應(yīng)參數(shù)與煙草樣品RT-PCR條件相同。⑤RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)用1 %瓊脂糖膠分離RT-PCR產(chǎn)物，每個(gè)樣品hHscFv-Rcr轉(zhuǎn) 錄水平通過使用凝膠成像系統(tǒng)FR-200A(FuRi Tech, Shanghai, China)自動(dòng)分析功能進(jìn)行計(jì) 算；附圖III。6.用western blot檢測(cè)hHscFv-Rcr蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的表達(dá)①蛋白提取(在冰浴上進(jìn)行)a.取5g煙草葉片，在加有液氮的研缽中研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)移至50mL聚丙烯離心 管中，并加入 5mL IXPBS(KH2PO4 0. 2g/L, Na2HPO4 1. 15g/L, KCl 0. 2g/L, NaCl 8g/L)；b. 13000rpm 4°C離心 30 分鐘；c.收集上清于另一新離心管中備用。②蛋白定量參考Bradford法(Bradford，1976)，取2 μ L蛋白樣品力口 98 μ L Bradford試劑混勻后，在酶標(biāo)儀下(Bio-TEK，USA)測(cè)OD595的吸光值。③SDS-PAGE分離蛋白SDS_PAGE制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a.樣品中加入等體積的含50mM DTT加樣緩沖液QX加樣緩沖液甘油2. 4g， IMTris-HCl ρΗ6· 8 ImL ；溴酚蘭0. 01%, H2O定容至20mL)，沸水浴10分鐘后置于冰上，冷 卻后上樣；b. 4°C冰箱中在100V電壓下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前 沿達(dá)到凝膠底部；c.聚丙烯酰胺凝膠，其中一塊用于考馬斯亮蘭(w ν = 2. 5% )染色，另一塊用 于 Westernblot 分析。④蛋白質(zhì)向PVDF膜上轉(zhuǎn)移a.轉(zhuǎn)移之前，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mM甘氨酸，48mM Tris Base，0. 037% SDS，20%甲醇)平衡凝膠和PVDF膜30分鐘；b.室溫下用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移Ih，凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙；⑤PVDF膜蛋白檢測(cè)c.將PVDF膜浸在封閉液中，37°C緩慢搖動(dòng)、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶 粉溶于IOOmL的1 X PBS (含0. 5g疊氮鈉))；d.再將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37°C洗滌兩次，每次15分鐘；e.加入第一抗體(抗his tag的抗體)，37°C溫育30分鐘；同步驟b，洗滌三次；f.加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物)，37°C溫育30分鐘；同步驟b，洗 滌兩次；g.加入底物顯色觀察蛋白條帶，見附圖IV。7.煙草表達(dá)hHscFv-Rcr蛋白抗原結(jié)合的親和力檢測(cè)①消化各種癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為105/mL，將癌細(xì)胞倍比稀釋為1 2、1 4、 1 8。以不同濃度的細(xì)胞(即細(xì)胞濃度分別為lX105/mL、0. 5X105/mL、0. 25X 105/mL、 0. 125X 105/mL)作為抗原鋪板，200uL/孔，置5% C02孵箱中培養(yǎng)Mh。每個(gè)濃度抗原加10 個(gè)孔；②棄上清，以PBS輕輕洗板1次；③加4°C 預(yù)冷 0.05% 戊二醛，200 μ L/孔，以 PBS/0.05% Tween 洗 3 次；④30% H2A 1份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物 酶。蒸餾水洗1-2次。⑤滴加5% BSA封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體，不洗。⑥對(duì)于每個(gè)濃度抗原分別加入不同濃度的純化scFv，100 μ L/孔，濃度依次為 160ng/mL、128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL，置 37°C 2h。PBS (pH7. 2-7. 6)洗 3 次，每次 2分鐘；⑦每孔加入以封閉液稀釋1 10000的HRP標(biāo)記抗His-Tag抗體，100 μ L/孔，置 于 37°C lh。以 PBS (pH7. 2-7. 6)洗 3 次，每次 2 分鐘。⑧滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，置于20-37°C 20分鐘。PBS (pH7. 2-7. 6)洗3次， 每次2分鐘。⑨滴加試劑SABC,置于20-370C 20分鐘。PBS (ρΗ7· 2-7. 6)洗4次，每次5分鐘。⑩DAB顯色使用DAB顯色試劑盒，室溫顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，一般在5_30分 鐘之間。蒸餾水洗滌。11置酶標(biāo)儀(Bio-TEK，USA)中，在490nm波長讀數(shù)。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，抗體濃度 對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖?？勺鞒鏊臈l曲線，找出50% OD值時(shí)抗體濃度。代入以下公式Ka = η-1/2 X (nAb，-Ab)8.煙草表達(dá)hHscFv-Rcr蛋白生物活性檢測(cè)M MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 法檢測(cè)煙草表達(dá)的 hHscFv-Rcr 蛋白生物活性[Mosmann，T. (1983) J. Immunol. Methods 65， 55-63]。①用PBS法提取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草葉片總可溶蛋白，經(jīng)濾膜(Millipore， 0. 45 μ m)除菌后，用IXPBS將濃度調(diào)整至0.5 μ g/μ L。
②用RPMI-1640液體培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔IO3 4個(gè)細(xì)胞接種到96孔 板，每孔體積200 μ L C02，370C，飽和濕度下培養(yǎng)Mh。③隨后取100 μ L煙草總可溶蛋白(不同濃度梯度)加入96孔板，3次重復(fù)。④實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)肝細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、無藥和無細(xì)胞對(duì)照組。⑤將96孔板放在37°C的C02 (v/v = 5% )細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后每孔中加 入20 μ L的MTT試劑，再培養(yǎng)4小時(shí)；⑥在倒置顯微鏡(Olympus CKX31, Japan)下定期地觀察96孔板細(xì)胞，當(dāng)有清晰可 見的紫色沉淀產(chǎn)生時(shí)，每一孔中加入150μ L的DMSO (dimethyl sulfoxide)，隨后輕輕地?fù)u 動(dòng)96孔板，并將96孔板在室溫下(黑暗)放置15分鐘；⑦在酶標(biāo)儀(Bio-TEK，USA)讀OD57tl的吸光值，以樣品劑量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱 坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。⑧腫瘤細(xì)胞生長的抑制率(IC% )由下式求得ICV0=[(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值]X 100%轉(zhuǎn)基因煙草的hHscFv-Rcr蛋白生物活性的MTT檢測(cè)結(jié)果見圖VI。以上實(shí)施例中，“hHscFv-Rcr保守性變異多肽”是指與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列 相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸替 換所形成的多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表IhHscFv-Rcr保守性變異多肽氨基酸替換表
權(quán)利要求
1.一種hHscFv-Rcr氨基酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO. 2所示。
2.一種hHscFv-Rcr核苷酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO. 1中第56-1258位所示。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述序列的煙草系統(tǒng)表達(dá)hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征 在于，包括如下的步驟第一步、構(gòu)建含hHscFv-Rcr基因的表達(dá)載體將含有融合基因hHscFv-Rcr的克隆載體 質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收目標(biāo)DNA片段，獲得帶有相應(yīng)的粘性末端的目的基因hHscFv-Rcr，然后 將其克隆到煙草表達(dá)載體中，通過測(cè)序或酶切鑒定，在確保表達(dá)載體中的目的基因閱讀框 架正確的前提下，再將表達(dá)載體質(zhì)粒用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，獲得攜帶煙草表達(dá)載體的根 癌農(nóng)桿菌；第二步、煙草遺傳轉(zhuǎn)化將滅菌后的煙草種子播于發(fā)苗培養(yǎng)基上，取生長兩周左右的無 菌葉片，作為外植體用于轉(zhuǎn)化；第三步、hHscFv-Rcr功能蛋白提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述序列的煙草系統(tǒng)表達(dá)hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是， 所述的第二步具體包括2. 1)將含有目的基因表達(dá)載體的攜帶煙草表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌于搖菌培養(yǎng)至 OD600 = 0 . 8 1. 0時(shí)，室溫6，OOOrpm離心5 8分鐘；2. 2)棄上清，菌體用液體MS培養(yǎng)基重懸，然后加入準(zhǔn)備好的外植體浸泡8 10分鐘；2. 3)將浸染結(jié)束后的外植體取出，吸去表面殘余菌液；然后將外植體置于共培養(yǎng)培養(yǎng) 基上在25°C共培養(yǎng)36小時(shí)；2. 4)共培養(yǎng)結(jié)束后將外植體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，在25 光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)7 15天可見愈傷組織的形成，約20天后可見分化芽長出；2. 5)待再生芽長至約3-4厘米時(shí)，將其切下移植到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，7 10 天左右生根；2. 6)形成完整根系后，將植株取出，用自來水洗去附著在根系上的固體培養(yǎng)基，在珍珠 巖中馴化并用質(zhì)量體積百分比為的MS粉水溶液補(bǔ)充營養(yǎng)和水分，一周后移入土中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述序列的煙草系統(tǒng)表達(dá)hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是， 所述的發(fā)苗培養(yǎng)基的組分及其質(zhì)量百分比為MS粉0. 22%、蔗糖3%、煙草凝膠0.沈％，余 量為蒸餾水；該發(fā)苗培養(yǎng)基的PH值為5. 8。
6.據(jù)權(quán)利要求4所述序列的煙草系統(tǒng)表達(dá)hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是， 所述的液體MS培養(yǎng)基的組分及其質(zhì)量百分比為MS粉0. 44%、蔗糖為3%，余量為蒸餾水； 該液體MS培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述序列的煙草系統(tǒng)表達(dá)hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是， 所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分及其質(zhì)量百分比為MS粉0. 44%、蔗糖3%、煙草凝膠0. 26%, 6-芐氨基嘌呤0. 0001 %、α -萘乙酸0. 00001 %，余量蒸餾水；該共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值5. 8。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述序列的煙草系統(tǒng)表達(dá)hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是， 所述的分化培養(yǎng)基的組分及其質(zhì)量百分比MS粉0. 44%、蔗糖3%、煙草凝膠0.沈％、6-芐 氨基嘌呤0. 0001 %、α -萘乙酸0. 00001%、卡那霉素0. 005%、羧芐青霉素0. 025%，余量 蒸餾水；該分化培養(yǎng)基的PH值5. 8。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述序列的煙草系統(tǒng)表達(dá)hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是，所述的生根培養(yǎng)基的組分及其質(zhì)量百分MS粉0. 44%、蔗糖3%、煙草凝膠0.沈％、6-芐氨 基嘌呤0. 0001%、α -萘乙酸0. 00001%、卡那霉素0. 005%、羧芐青霉素0. 025%，余量蒸 餾水；該生根培養(yǎng)基的PH值5. 8。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的hHscFv-Rcr基因序列及轉(zhuǎn)基因煙草的制備方法，該基因序列為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其煙草系統(tǒng)表達(dá)hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，包括構(gòu)建含hHscFv-Rcr基因的表達(dá)載體、煙草遺傳轉(zhuǎn)化以及功能hHscFv-Rcr蛋白提取，本發(fā)明通過構(gòu)建植物表達(dá)載體，在植物中表達(dá)hHscFv-Rcr活性多肽，產(chǎn)品對(duì)防止和治療肝癌方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102060930SQ20101056472
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者宋維, 崔麗潔, 張冉, 彭會(huì)珍, 趙凌俠 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)