專利名稱：一種固氮螺菌的發(fā)酵方法與由該方法得到的發(fā)酵液及其用途的制作方法
一種固氮螺菌的發(fā)酵方法與由該方法得到的發(fā)酵液及其用
途
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物技術領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種固氮螺菌的發(fā)酵方法，還 涉及由該方法得到的發(fā)酵液，涉及所述發(fā)酵液的用途。
背景技術：
生物固氮是地球化合態(tài)氮素的主要來源，據(jù)統(tǒng)計，地球上60%化合態(tài)氮源于生物 固氮作用。目前，農(nóng)業(yè)上使用的化合態(tài)氨來自于合成氨工業(yè)，合成氨消耗巨大的能源，而且 大量使用化學合成氮肥已對自然環(huán)境造成了嚴重的污染，同時也威脅著食品安全。在農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)中充分有效的利用生物進行固氮，更高的發(fā)揮生物固氮的效力，是解決上述問題的主 要途徑之一。自上世紀二十年代起相繼開展了生物固氮方面的研究，根據(jù)固氮生物和植物 之間的相互作用關系，通常將自然界中存在的固氮體系分為共生固氮，聯(lián)合固氮和自生固 氮三種。目前，共生固氮菌的作用機理研究的較透徹，且在世界范圍內(nèi)已開發(fā)出多款產(chǎn)品， 其推廣和應用規(guī)模也逐漸形成規(guī)模；世界上很多國家的豆科作物都接種根瘤菌，尤其是美 國和巴西，豆科作物接種共生固氮菌(即豆科根瘤菌)幾乎接近100% ；但是共生固氮菌的 作用作物范圍較窄，應用范圍有限。聯(lián)合固氮菌由于其作用范圍廣泛，越來越受到人們的重視。聯(lián)合固氮菌中研究較 多的是固氮螺菌屬(Azospirillum)，該類固氮螺菌分布廣泛，可定植于多種禾本科作物根 際，分泌植物生長激素和抗真菌的抗生素，促進種子發(fā)芽和根的生長。20世紀70年代末和 80年代初，一些國家對固氮螺菌的應用效果進行了田間試驗，表明固氮螺菌接種在土壤和 氣候不同的地區(qū)可以提高作物的產(chǎn)量，在60% -70%的試驗中可增產(chǎn)5% -30%。固氮螺 菌與禾本科作物聯(lián)合固氮的研究取得了一定的進展，部分國家也將固氮螺菌作為接種劑使 用，但是，固氮螺菌作為作物接種劑尚未能產(chǎn)業(yè)化。自生固氮菌中研究較多的一類可固氮的 光合細菌，該類細菌不僅可以固氮，而且可以合成多種水產(chǎn)養(yǎng)殖類動物所需要的色素，自生 固氮研究的模式菌為深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)。目前，關于固氮螺菌的研究多集中于菌株的改造，色素合成和固氮機理的研究，對 于固氮螺菌的發(fā)酵和作為商品化的微生物菌劑研究的較少。CN 03109679. 4公開了一種促 進植物生長型的微生物菌劑制備方法。所述的微生物菌劑由棕色固氮菌、固氮螺菌、巨大芽 孢桿菌和涇陽鏈霉菌按比例組成。該菌劑能促進植物對土壤中礦物元素的吸收利用，抑止 根部病原體，可與部分無機肥混合制備無機生物復合肥，提高作物產(chǎn)量，同時還可改善作物 的品質(zhì)。CN 200780101303. 0涉及新的生物肥料，所述肥料包含分散泛菌C3菌株的純培養(yǎng) 物、巴西固氮螺菌M3菌株的純培養(yǎng)物和吲哚-3-乙酸，它們?nèi)抗潭ㄓ趩蝹€固體介質(zhì)中，起 緩釋體系的作用。目前，固氮螺菌作為微生物菌劑尚未規(guī)?；褂玫脑蚴?)固氮螺菌發(fā)酵單位 較低，一般僅有30-50億/ml ；2)保存時間較短，尤其是巴西固氮螺菌，液體菌劑在室溫下保 存僅3個月；3)應用效果受限于使用方法。因此，固氮螺菌規(guī)?；瘧檬滓鉀Q的問題是其發(fā)酵水平和成本，發(fā)酵水平的提高可降低發(fā)酵成本，提高固氮螺菌存活率，保證產(chǎn)品質(zhì) 量，有益于應用效果的體現(xiàn)和該類菌劑的商品化。為此，本發(fā)明人針對現(xiàn)有技術存在的問題，經(jīng)過大量試驗克服了這些缺陷，終于完 成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術問題]本發(fā)明的目的是提供一種固氮螺菌的發(fā)酵方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有所述固氮螺菌的發(fā)酵液。本發(fā)明的另一個目的是提供含有所述固氮螺菌發(fā)酵液的用途。[技術方案]本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種固氮螺菌的發(fā)酵方法。該方法包括下述步驟A)菌種活化LB固體培養(yǎng)基的制備分別稱取氯化鈉、酵母浸粉、蛋白胨，混合后用蒸餾水或自 來水溶解，得到以重量百分數(shù)表示的0. 8-1. 2%氯化鈉、0. 4-0. 6%酵母浸粉、0. 8-1. 2%蛋 白胨、用無機堿或無機酸將該溶液的PH調(diào)節(jié)至6. 8-7. 0，然后加入1. 6-2. 4%瓊脂粉，再在 溫度121°C下高壓滅菌30分鐘后，再放置在室溫下靜置得到LB固體培養(yǎng)基。把固氮螺菌菌體放在所述的LB固體培養(yǎng)基上進行活化，在培養(yǎng)溫度28-32°C下培 養(yǎng)至單菌落直徑達到2-3_，菌落呈現(xiàn)淡紅色或淺乳黃色。所述的固氮螺菌是以有機酸作為底物的紅螺菌屬和固氮螺菌屬的菌株。固氮螺菌是作物生長的有力促進者。對作物來講，固氮螺菌不與作物形成特殊的 結(jié)構，而是定植于作物的根際，不同于豆科作物與根瘤菌之間的共生關系，所以它能夠用于 非豆科作物，例如小麥、玉米、大麥、棉花等各種作物。固氮螺菌除固氮作用外，它的分泌物 對促進作物生長也有非常明顯的作用，它們能夠使作物根系發(fā)達，這樣，就能夠使作物從土 壤中吸取更多的水份、礦物質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)，于是能夠顯著改善作物生長狀況，增強作物 抗逆性，抑制病原微生物，從而能夠提高作物產(chǎn)量，同時可以減少化肥的使用量。紅螺菌屬拉丁學名(Rhodospirillum Molisch, 1907)，細胞弧形或螺旋形， 0.8_1.5μπι寬，極生鞭毛運動，細胞行二分分裂，革蘭氏染色陰性。屬α-變型菌綱 (Proteobacteria)。光合內(nèi)膜囊泡狀或片層狀。光合色素為細菌葉綠素a和螺菌黃素類類 胡蘿卜素。醌類以Q或RQ為主。細胞喜在光照厭氧條件下光異養(yǎng)生長。但可在黑暗條件 下微好氧或好氧生長；生長需生長因子。模式種深紅紅螺菌(R. rubrum)。優(yōu)選地，LB固體培養(yǎng)基的組成是以重量百分數(shù)表示的1. 0%氯化鈉、0. 5%酵母浸 粉、1. 0%蛋白胨和2. 0%瓊脂粉。所述的無機堿是NaOH或Κ0Η。所述的無機酸是磷酸或硫酸。作為調(diào)節(jié)pH使用的無機堿或無機酸的濃度不是特別關鍵的，但通常使用的濃度 是 0. 1-1. ON,優(yōu)選地 0. 4-0. 8N。
本發(fā)明使用的氯化鈉、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉都是目前市場上銷售的在微生物 技術領域里普遍使用的物質(zhì)，例如所述的瓊脂、酵母浸膏粉是北京奧博星生物技術有限公 司生產(chǎn)的產(chǎn)品，其余試劑是北京試劑公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。菌種活化使用的設備也是在微生物技術領域里普遍使用的設備。B)擴大培養(yǎng)擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基的制備稱取下述原料用蒸餾水或自來水 溶解，再用無機 堿或無機酸將溶液的PH調(diào)節(jié)至6. 8-7. 0，再在溫度121°C下高壓滅菌30分鐘，冷卻得到所 述的擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基以重量百分數(shù)表示，0. 12-2.0% C2-C4有機酸、0.05-0. 15%選自氯化銨或硫酸銨 的無機銨鹽、0. 05-0. 3%選自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有機氮源、0. 02-0. 03%硫 酸鎂、0. 01-0. 磷酸鹽和0. 001-0. 01%選自氯化鐵、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、鉬酸鈉 或檸檬酸鐵的微量元素化合物。把步驟A)活化的菌體接入擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中，在溫度28-32°C下振蕩培養(yǎng) 細胞至對數(shù)生長期中期。優(yōu)選地，擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基的組成是以重量百分數(shù)表示的0. 14-1.8% C2-C4 有機酸、0. 08-0. 12%選自氯化銨或硫酸銨的無機銨鹽、0. 1-0. 2%選自酵母粉、蛋白胨或酶 水解酪蛋白的有機氮源、0. 02-0. 03%硫酸鎂、0. 02-0. 08%磷酸鹽和0. 002-0. 008%選自氯 化鐵、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、鉬酸鈉或檸檬酸鐵的微量元素化合物。根據(jù)本發(fā)明，所述的C2-C4有機酸應該理解是碳原子數(shù)為2-4的有機酸，例如乙酸、 乳酸或蘋果酸。所述的磷酸鹽是磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀，它們的濃度分別為0. l_2.0g/L和 0. 4-1. 6g/L，并且二者組成非緩沖體系對。在作為調(diào)節(jié)pH使用的無機堿或無機酸中，所述的無機堿是NaOH或Κ0Η。所述的無 機酸是鹽酸或硫酸。它們的濃度不是特別關鍵的，但通常使用的濃度是0. 1-1. 0N，優(yōu)選地 0. 4-0. 8N。本發(fā)明擴大培養(yǎng)使用的設備也是在微生物技術領域里普遍使用的設備。在本發(fā)明中采用高壓蒸氣滅菌，高壓蒸氣滅菌是水在大氣中在100°C沸騰，在密閉 的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨 之增加。在0. IMPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121°C。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌 及其高度耐熱的芽孢。在本發(fā)明中，高壓滅菌使用的設備例如可以是北京安捷來科學儀器設備有限公司 銷售的高壓滅菌器。C)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備稱取下述原料用蒸餾水或自來水溶解，再用無機 堿或無機酸將溶液的PH調(diào)節(jié)至6. 8-7. 0，再在溫度121°C下高壓滅菌30分鐘，冷卻得到所 述的發(fā)酵培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基以重量百分數(shù)表示，0. 5-2. 5% C2-C4有機酸、0. 1-0. 15%選自氯化銨或硫酸銨的 無機銨鹽、0. 1-0. 3%選自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有機氮源、0. 02-0. 03%硫酸 鎂、0. 01-0. 磷酸鹽和0. 001-0. 01%選自氯化鐵、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、鉬酸鈉或檸檬酸鐵的微量元素化合物；優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基的組成是以重量百分數(shù)表示的0. 4-2. 0% C2-C4有 機酸、0. 12-0. 14%選自氯化銨或硫酸銨的無機銨鹽、0. 15-0. 25%選自酵母粉、蛋白胨或酶 水解酪蛋白的有機氮源、0. 02-0. 03%硫酸鎂、0. 01-0. 磷酸鹽和0. 001-0. 01%選自氯化 鐵、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、鉬酸鈉或檸檬酸鐵的微量元素化合物。根據(jù)本發(fā)明，所述的C2-C4有機酸是乙酸、乳酸、蘋果酸。所述的磷酸鹽例如可以是 磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鈉或磷酸二氫鈉等。在作為調(diào)節(jié)pH使用的無機堿或無機酸中，通常使用NaOH或KOH與磷酸或硫酸。它 們的濃度通常是0. 1-1. 0N，優(yōu)選地0. 4-0. 8N。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)使用的設備也是在微生物技術領域里普遍使用的設備。在本發(fā)明中，高壓滅菌使用的設備例如可以是北京安捷來科學儀器設備有限公司 銷售的高壓滅菌器。以所述的發(fā)酵培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基(以體積計)把3-10%在步驟B)擴大培養(yǎng)的菌 體接入發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度28-32°C下進行發(fā)酵，并且進行如下控制，直至細胞生長進入 對數(shù)生長后期，終止發(fā)酵，并進行平板稀釋涂布計數(shù)(1)在固氮螺菌細胞生長延滯期將轉(zhuǎn)速控制在100-300r/min，溶氧控制在 0. 3-0. 5vvm(air volume/culture volume/min,通氣比)；(2)在細胞對數(shù)生長期將轉(zhuǎn)速控制在200-500r/min，溶氧控制在0. 5-0. 8vvm,優(yōu) 選地轉(zhuǎn)速控制在450-500r/min，溶氧控制在0. 75-0. 8vvm。(3)在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，根據(jù)pH變化進行C2-C4有機酸補料，即采用pH偶聯(lián)的補 料方式進行C2-C4有機酸補料，以便保證在發(fā)酵過程中碳源濃度處于恒定水平；所述補料液 的C2-C4有機酸重量百分濃度為20-90%，優(yōu)選地，所述補料液的C2-C4有機酸濃度是重量百 分濃度30-40%。優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基初始碳氮比是5-17 1。所述的平板稀釋涂布計數(shù)方法描述如下將發(fā)酵液稀釋10—1到10_8，并選取10_6、ΙΟ"7和10_83個梯度的稀釋液，取100 μ 1涂 布于所述的LD固體培養(yǎng)基上(每個梯度三個平行)，在溫度28-32°C下培養(yǎng)至單菌落直徑 達到2-3mm，然后選取20-100個單菌落/平板的稀釋梯度的平板，求得該稀釋梯度下的菌落 平均數(shù)，并計算其發(fā)酵液活菌數(shù)。在10_7梯度下求得的菌落平均數(shù)的數(shù)值即是發(fā)酵液中活 菌數(shù)(活菌數(shù)的單位為億/ml)。采用所述的平板稀釋涂布計數(shù)方法測定得到，采用本發(fā)明方法制備的發(fā)酵液的活 菌數(shù)可以達到70-120億個/ml。本發(fā)明還涉及采用本發(fā)明發(fā)酵方法得到的發(fā)酵液，其特征在于它含有的固氮螺菌 活菌數(shù)為70-120億個/ml。本發(fā)明還涉及所述的發(fā)酵液在制備固氮微生物肥料中的用途。[有益效果]本發(fā)明方法實施簡便，可以得到活菌數(shù)為70-120億個/ml的發(fā)酵液，遠高于現(xiàn)有 技術的30-50億個/ml，而且本發(fā)明發(fā)酵液在室溫下保存12個月以上，固氮螺菌活菌數(shù)可完 全滿足制備固氮微生物肥料的要求。使用含有本發(fā)明固氮螺菌發(fā)酵液的微生物肥料不僅增
7產(chǎn)效果明顯，例如玉米可增產(chǎn)5-10%，水稻可增產(chǎn)3-6% ；不僅如此，還能大大增強作物的抗 逆性
圖1是不補料條件下巴西固氮螺菌生長曲線圖2是磷酸鹽緩沖體系條件下巴西固氮螺菌的生長曲線圖3是巴西固氮螺菌在pH偶聯(lián)的補料及分階段控制溶氧條件下的生長曲線圖4是深紅紅螺菌在pH偶聯(lián)的補料及分階段控制溶氧條件下的生長曲線
具體實施方式實施例1本實施例的固氮螺菌發(fā)酵方法是不進行補料條件下的發(fā)酵，發(fā)酵過程中pH值隨 著培養(yǎng)時間逐漸增加。該方法實施步驟如下A)菌種活化LB固體培養(yǎng)基的制備分別稱取氯化鈉、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉，混合后用蒸 餾水溶解，得到以重量百分數(shù)表示的1.0%氯化鈉、0.5%酵母浸粉、1.0%蛋白胨的溶液，用 0. IN氫氧化鈉水溶液或0. IN磷酸水溶液將該溶液的pH調(diào)節(jié)至6. 8-7. 0，加入2. 0%的瓊脂 粉，再在溫度121°C下高壓滅菌30分鐘后，再放置在室溫下靜置得到LB固體培養(yǎng)基。將Azospirillum brasilense Yu62接種到所述的LB固體培養(yǎng)基上，在溫度30°C 下培養(yǎng)40-48h，得到單菌落直徑達到2-3mm，菌落呈現(xiàn)淺乳黃色，菌苔有褶皺現(xiàn)象。B)擴大培養(yǎng)擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基的制備稱取下述原料用蒸餾水溶解，再用0. IN氫氧化鈉 水溶液或0. IN磷酸水溶液將溶液的pH調(diào)節(jié)至6. 8-7. 0,再在溫度121°C下高壓滅菌30分 鐘，冷卻得到所述的擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基以重量百分數(shù)表示，2%乳酸、0. 10%氯化銨、0. 15%酵母粉、0.02%硫酸鎂、 0. 05%磷酸一氫鉀和0. 005%氯化鐵微量元素化合物。將步驟A)活化的菌種接種于裝有20_25ml上述擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基的50ml的 三角瓶中，在溫度30°C下以180r/min振蕩15_18h，菌體生長至對數(shù)中期。C)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備稱取下述原料用蒸餾水溶解，再用0. IN氫氧化鈉 水溶液或0. IN鹽酸將溶液的pH調(diào)節(jié)至6. 8-7.0，再在溫度121°C下高壓滅菌30分鐘，冷卻 得到所述的發(fā)酵培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基以重量百分數(shù)表示，2.0%乳酸、0. 12%硫酸銨、0.2%酵母粉、0.03%硫酸鎂、 0. 05%磷酸一氫鉀和0. 005%氯化鐵微量元素化合物；將步驟B)得到的種子接種到5L發(fā)酵罐中(裝液量為60%)，接種量為10%。發(fā)酵 溫度為30°C，發(fā)酵過程中攪拌轉(zhuǎn)速控制在350-400r/min，溶氧控制在0. 5vvm，發(fā)酵過程中 不調(diào)節(jié)PH值，也不進行補料，通過上述控制工藝，發(fā)酵周期為16-20h(見附圖1)，在600nm 處細胞吸光值可達到7-80D (光密度)，并通過稀釋平板計數(shù)，發(fā)酵液活菌數(shù)可達到31-33億/ml。實施例2本實施例的實施方式與實施例1相同，但是在發(fā)酵過程中將磷酸鹽制備成緩沖體 系對，使發(fā)酵過程中PH基本不發(fā)生變化，pH值偶聯(lián)的補料不能進行。該方法實施步驟如下本實施例按照實施例1的步驟A和B進行，而發(fā)酵過程按照下述方式進行1)發(fā)酵培養(yǎng)基將磷酸二氫鉀由0. 4g/L改變?yōu)?. 52g/L，將磷酸氫二鉀由0. lg/L 改變?yōu)?. 4g/L，使磷酸鹽形成緩沖體系對，在在發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌時，磷酸鹽需要單獨滅菌， 并在接種前加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。2)發(fā)酵培養(yǎng)將活化好的種子接種到5L發(fā)酵罐中(裝液量為60%)，接種量為 10%。發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵過程中攪拌轉(zhuǎn)速為450r/min，通氣量為O.Svvm。通過上述工 藝控制，發(fā)酵16h后，細胞生長趨緩，18h終止發(fā)酵(見附圖2)；在600nm出的細胞吸光值可 達到130D，并通過稀釋平板計數(shù)，發(fā)酵液活菌數(shù)可達到82. 3億/ml。實施例3本實施例的固氮螺菌發(fā)酵方法是以pH值偶聯(lián)的補料方式及階段性控制溶氧相結(jié) 合的發(fā)酵工藝進行控制。該方法實施步驟如下該實施例使用的培養(yǎng)基和實施方式與實施例1的相同，但是在發(fā)酵過程中溶氧和 PH偶聯(lián)的補料方式為攪拌轉(zhuǎn)速控制方式是在0-8h，350-400r/min,在8_16h，450-500r/min ；通氣量控 制方式是在0-8h，0. 5vvm ；8h到發(fā)酵結(jié)束的通氣量為0. 8vvm，補料的乳酸濃度為30%。通 過上述工藝控制，發(fā)酵16-18h細胞進入對數(shù)生長后期，終止發(fā)酵；發(fā)酵周期為16-18h(見附 圖3)，在600nm處細胞吸光值可達到15-180D，并通過稀釋平板計數(shù)，發(fā)酵液活菌數(shù)可達到 110-125 億/ml。實施例4本實施例描述以深紅紅螺菌作為研究對象，進行pH偶聯(lián)的補料方式及階段性溶 氧控制的細胞生長。該實施例的實施步驟如下A)菌種活化將 Rhodospirillum rubrum ATCCl 170接種到斜面LB培養(yǎng)基上，30°C 培養(yǎng)40-48h，活化好的菌種的單菌落直徑2-3mm，菌落呈現(xiàn)深紅色，且單菌落直徑2_3mm。B)種子培養(yǎng)將步驟1活化的菌種接種于裝有20_25ml液體培養(yǎng)基的50ml的三 角瓶中，30°C振蕩20-24h (振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為lOOr/min)。C)種子培養(yǎng)將步驟2得到的菌種取IOml接種于裝有150_200ml用于擴大培養(yǎng) 的液體培養(yǎng)基中(500ml的三角瓶中)，30°C振蕩培養(yǎng)15_20h (振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為lOOr/min)。D)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟C)中活化好的種子接種到5L發(fā)酵罐中(裝液量為60%)，發(fā) 酵培養(yǎng)基的磷酸鹽濃度為磷酸氫二鈉0.03%，磷酸二氫鈉0.07%，接種量為10%。發(fā)酵 溫度為30°C，發(fā)酵過程中攪拌轉(zhuǎn)速控制為0-8h，100-200r/min，8h至發(fā)酵結(jié)束，200_300r/ min ；通氣量控制為0-8h，0. 2-0. 3 ；8h到發(fā)酵結(jié)束的通氣量為0. 3-0. 5，補料的蘋果酸濃度 為 20%。
通過上述工藝控 制，發(fā)酵4_8h細胞進入對數(shù)生長期，90_100h細胞生長至穩(wěn)定期， 終止發(fā)酵(見附圖4)；在600nm處細胞吸光值可達到10-120D，并通過稀釋平板計數(shù)，發(fā)酵 液活菌數(shù)可達到76億/ml。
權利要求
一種固氮螺菌的發(fā)酵方法，其特征在于該方法包括下述步驟A)菌種活化LB固體培養(yǎng)基的制備分別稱取氯化鈉、酵母浸粉、蛋白胨，混合后用蒸餾水或自來水溶解，得到以重量百分數(shù)表示的0.8 1.2％氯化鈉、0.4 0.6％酵母浸粉、0.8 1.2％蛋白胨，用無機械或無機酸將該溶液的pH調(diào)節(jié)至6.8 7.0，然后加入1.6 2.4％瓊脂粉，再在溫度121℃下高壓滅菌30分鐘后，再放置在室溫下靜置得到LB固體培養(yǎng)基；把固氮螺菌菌體在所述的LB固體培養(yǎng)基上進行活化，在培養(yǎng)溫度28 32℃下培養(yǎng)至單菌落直徑達到2 3mm；B)擴大培養(yǎng)擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基的制備稱取下述原料用蒸餾水或自來水溶解，再用無機堿或無機酸將溶液的pH調(diào)節(jié)至6.8 7.0，再在溫度121℃下高壓滅菌30分鐘，冷卻至室溫得到所述的擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基以重量百分數(shù)表示，0.12 2.0％ C2 C4有機酸、0.05 0.15％選自氯化銨或硫酸銨的無機銨鹽、0.05 0.3％選自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有機氮源、0.02 0.03％硫酸鎂、0.01 0.1％磷酸鹽和0.001 0.01％選自氯化鐵、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、鉬酸鈉或檸檬酸鐵的微量元素化合物；把步驟A)活化的菌體接入擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中，在溫度28 32℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期；C)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備稱取下述原料用蒸餾水或自來水溶解，再用無機堿或無機酸將溶液的pH調(diào)節(jié)至6.8 7.0，再在溫度121℃下高壓滅菌30分鐘，冷卻得到所述的發(fā)酵培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基以重量百分數(shù)表示，0.5 2.5％C2 C4有機酸、0.1 0.15％選自氯化銨或硫酸銨的無機銨鹽、0.1 0.3％選自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有機氮源、0.02 0.03％硫酸鎂、0.01 0.1％磷酸鹽和0.001 0.01％選自氯化鐵、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、鉬酸鈉或檸檬酸鐵的微量元素化合物；以所述的發(fā)酵培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基(以體積計)把3 10％在步驟B)擴大培養(yǎng)的菌體接入發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度28 32℃下進行發(fā)酵，并且進行如下控制，直至細胞生長進入對數(shù)生長后期，終止發(fā)酵，并進行平板稀釋涂布計數(shù)(1)在固氮螺菌細胞生長延滯期將轉(zhuǎn)速控制在100 300r/min，溶氧控制在0.3 0.5vvm；(2)在細胞對數(shù)生長期將轉(zhuǎn)速控制在200 500r/min，溶氧控制在0.5 0.8vvm；(3)在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，根據(jù)pH變化進行C2 C4有機酸補料，以便保證在發(fā)酵過程中碳源濃度處于恒定水平；所述補料液的C2 C4有機酸重量百分濃度為20 90％。
2.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的固氮螺菌是以有機酸作為底物 的紅螺菌屬和固氮螺菌屬的菌株。
3.根據(jù)權利要求1的發(fā)酵方法，其特征在于所述的無機堿是NaOH或Κ0Η。
4.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的無機酸是鹽酸或硫酸。
5.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的C2-C4有機酸是可以是乙酸、乳酸或蘋果酸。
6.根據(jù)權利要求1或5所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述的C2-C4有機酸的重量百分 濃度為30-40%。
7.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于在細胞對數(shù)生長期，將轉(zhuǎn)速控制在 450-500r/min，溶氧控制在 0. 75-0. 8vvm。
8.根據(jù)權利要求1所述，其特征在于所述的磷酸鹽是磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀，它們 的濃度分別為0. 1-2. Og/L和0. 4-1. 6g/L，并且二者組成非緩沖體系對。
9.采用權利要求1-8權利要求所述發(fā)酵方法得到的發(fā)酵液，其特征在于它含有的固氮 螺菌活菌數(shù)為70-120億個/ml。
10.根據(jù)權利要求9所述的發(fā)酵液在制備固氮微生物肥料中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及一種固氮螺菌的發(fā)酵方法，還涉及由該方法得到的發(fā)酵液及其用途。本發(fā)明的固氮螺菌發(fā)酵方法包括菌種活化、擴大培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)等步驟。本發(fā)明通過pH偶聯(lián)的補料方式和控制不同發(fā)酵階段的溶氧，使固氮螺菌的發(fā)酵水平大幅度提高，發(fā)酵菌數(shù)可達到70-120億/ml，固氮螺菌活菌數(shù)可完全滿足制備固氮微生物肥料的要求，本發(fā)明的發(fā)酵控制方法簡單，并易于發(fā)酵規(guī)模的放大。使用含有本發(fā)明固氮螺菌發(fā)酵液的微生物肥料增產(chǎn)效果明顯，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C05F11/08GK101967461SQ20101051488
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權日2010年10月22日
發(fā)明者崔曉燦, 徐志文, 朱瑞艷, 殷光 申請人:秦皇島領先科技發(fā)展有限公司