專利名稱：一種應(yīng)用于豬、雞養(yǎng)殖的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于豬、雞養(yǎng)殖的制劑，具體是由粘膜乳桿菌制成的制劑在促進(jìn)豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉(zhuǎn)化率中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2006年底在全國爆發(fā)的大菱鲆藥殘事件給我們敲響了警鐘。歐盟已于2006年全面禁止抗菌藥作為飼料添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用。為保證食品安全，美國等發(fā)達(dá)國家對(duì)肉類、海產(chǎn)品等抗菌藥殘留進(jìn)行檢測。隨著中國加入世貿(mào)組織，名優(yōu)產(chǎn)品出口被普遍看好。 但由于國內(nèi)養(yǎng)殖不科學(xué)使用抗生素等有害藥物的現(xiàn)象嚴(yán)重，大大限制了產(chǎn)品的出口?？咕幪娲a(chǎn)品是豬和雞養(yǎng)殖業(yè)中迫切需要的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉(zhuǎn)化率的制劑，該制劑由粘膜乳桿菌制成。本發(fā)明的制劑的制備優(yōu)選是通過下述步驟實(shí)施的，但不局限于此制備工藝，公知的能實(shí)現(xiàn)的制備工藝均可以采取可能含粘膜乳桿菌的樣本，然后將樣品置于滅菌厭氧瓶內(nèi)，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混合，迅速從中取一定量的樣品加入18mL滅菌的稀釋液中，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混勻，在無菌操作臺(tái)內(nèi)，進(jìn)行10—1、10_2、10_3、ΙΟ"4, ΙΟ"5, ΙΟ"6, ΙΟ"7梯度稀釋，取 ΙΟ"5, ΙΟ"6, ΙΟ"7三個(gè)稀釋梯度，分別涂布于粘膜乳桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下培養(yǎng)48小時(shí)，選擇長勢良好的單菌落分別接種于液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，然后根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》、相關(guān)細(xì)菌鑒定文獻(xiàn)或16S rRNA序列對(duì)比分析進(jìn)行粘膜乳桿菌鑒定和毒性試驗(yàn)，將無毒性的粘膜乳桿菌干燥菌粉按需要比例添加輔料制成片劑、膠囊、散劑、粉劑或液體制劑等各種劑型，或制成獸藥和飼料添加劑，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到協(xié)同作用。粘膜乳桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于純化水IOOOmL,胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，三水醋酸鈉晶體5g，檬酸三銨2g，MgSO4. 7H20 0. 2g，瓊脂15g，肉浸膏 10g，葡萄糖 20g,吐溫-80 lmL，磷酸氫二鉀 2g, MnSO4. 2H20 0. 05g。調(diào) ρΗ6· 2-6. 3，121 °C 高壓滅菌15min。粘膜乳桿菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于純化水lOOOmL，胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，三水醋酸鈉晶體5g，檬酸三銨2g，MgSO4. 7H20 0. 2g，肉浸膏10g，葡萄糖20g,吐溫-80 lmL，磷酸氫二鉀 2g，MnSO4. 2H20 0. 05g。調(diào) pH6. 2-6. 3，121°C 高壓滅菌 15min。為進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，發(fā)明人利用上述方法通過粘膜乳桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基分離鑒定出了無毒性的粘膜乳桿菌，本發(fā)明所述粘膜乳桿菌并不局限于為說明本發(fā)明所述的菌株，只要無毒性的粘膜乳桿菌均是本發(fā)明所述，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明所述粘膜乳桿菌優(yōu)選但不限于粘膜乳桿菌DH103保藏編號(hào)CGMCC3766、粘膜乳桿菌DH105保藏編號(hào)CGMCC3765或粘膜乳桿菌DH106保藏編號(hào)CGMCC3763。本發(fā)明實(shí)施說明中優(yōu)選使用的粘膜乳桿菌的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)1、為說明本發(fā)明，本發(fā)明利用上述方法分離的粘膜乳桿菌分別為粘膜乳桿菌 DH103保藏編號(hào)CGMCC3766、粘膜乳桿菌DH105保藏編號(hào)CGMCC3765或粘膜乳桿菌DH106保藏編號(hào) CGMCC3763。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察桿菌，革蘭氏染色陽性。平板形態(tài)菌落呈乳白色、表面光滑、圓潤、凸出于培養(yǎng)基表面、大小l_2mm。3、生理生化鑒定明膠液化_ ；過氧化氫酶_ ；硫化氫_ ；硝酸鹽還原_ ；是否需氧厭氧性。4、糖酵解實(shí)驗(yàn)鑒定葡萄糖+ ；核糖+ ；麥芽糖+ ；蔴糖+ ；葡糖酸+ ；D-木糖+ ；蜜二糖+ ；D-棉子糖+ ；D-果糖_ ；丙三醇_ ；赤蘚糖醇_ ；L-木糖-；側(cè)金盞花醇_ ；肌醇_ ；山梨醇_ ； 纖維二糖_ ；海藻糖_ ；松三糖_ ；甘露醇_ ；菊粉_。5、分離菌株進(jìn)行16S rRNA基因測序，測得序列用BLAST與GenBank和RDP數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行相似性分析，確定分離菌株均為粘膜乳桿菌。本發(fā)明所述的粘膜乳桿菌指活生物個(gè)體。本發(fā)明是以有效劑量的上述粘膜乳桿菌作為主要藥物活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、濕潤劑、黏合劑、溶劑、增稠劑、 增溶劑等輔料，制成任何一種適合于使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑、 粉劑等劑型。本發(fā)明所述以有效劑量的上述粘膜乳桿菌作為主要藥物活性成份制成活菌制劑， 也可以是上述粘膜乳桿菌與雙歧桿菌、鏈球菌、枯草芽孢桿菌等益生菌中的一種或幾種或其他活性成份組合制成活菌制劑，以起到協(xié)同作用，提高效果。本發(fā)明所指有效劑量是指以上述粘膜乳桿菌根據(jù)上面所述單獨(dú)或組合作為主要藥物活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于lX106CFU/g，一般在 1 X 109CFU/g 以上，最高可達(dá)至Ij 1 X 10"CFU/g 或 1 X 10"CFU/g 以上。本發(fā)明所指有效劑量是指以上述粘膜乳桿菌根據(jù)上面所述單獨(dú)或組合作為主要藥物活性成份制成的液體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于lX106CFU/mL，一般在 1 X 109CFU/mL 以上，最高可達(dá)到 1 X 10nCFU/mL 或 1 X 10nCFU/mL 以上。由于本發(fā)明首次公開了粘膜乳桿菌作為主要活性成份制成制劑在豬、雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用，因此含上述粘膜乳桿菌的制劑在豬、雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述的粘膜乳桿菌在制成任何一種劑型時(shí)，均具有促進(jìn)豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用。任何劑型，如果其組份中含有上述粘膜乳桿菌成份制備成制劑，在其包裝或說明書等標(biāo)識(shí)上或者在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有促進(jìn)豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用，則落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明所述的粘膜乳桿菌可以制成獸藥或飼料添加劑。將上述粘膜乳桿菌制成的獸藥或飼料添加劑應(yīng)用于促進(jìn)豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉(zhuǎn)化率等豬、雞養(yǎng)殖中，則落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
具體實(shí)施例方式制備例說明上述已經(jīng)對(duì)粘膜乳桿菌制劑的制備進(jìn)行說明，這里通過粘膜乳桿菌 DH103保藏編號(hào)CGMCC3766、粘膜乳桿菌DH105保藏編號(hào)CGMCC3765或粘膜乳桿菌DH106保藏編號(hào)CGMCC3763粉劑為例進(jìn)行具體說明，其他粘膜乳桿菌菌種制劑的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實(shí)施例很容易掌握，其他劑型的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實(shí)施很容易掌握，在此不再一一敘述說明。制備方法并不局限于本發(fā)明實(shí)施例所述，公知的能夠達(dá)到制備目的的方法均可以，實(shí)施例的制備說明只是對(duì)本發(fā)明的說明，并不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。制備實(shí)施例1粘膜乳桿菌粉劑的制備1菌粉的制備和菌種的鑒定采取小豬、雞或牛等動(dòng)物的糞便，然后將糞便置于滅菌厭氧瓶內(nèi)，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混合，迅速從中取2克糞便加入ISmL滅菌的稀釋液中，吹入氮?dú)馔瑫r(shí)充分混勻，在無菌操作臺(tái)內(nèi)，進(jìn)行IO-1UO-2UO-3UO-4, ΙΟ"5, ΙΟ"6,10_7梯度稀釋，取ΙΟ"5, ΙΟ"6,10_7三個(gè)稀釋梯度， 涂布于粘膜乳桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下培養(yǎng)48小時(shí)，選擇長勢良好的單菌落接種到粘膜乳桿菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C 下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為lX109CFU/g以上，然后進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)生理生化和16S rRNA序列對(duì)比分析鑒定為粘膜乳桿菌，分別為粘膜乳桿菌DH103保藏編號(hào)CGMCC3766、粘膜乳桿菌DH105保藏編號(hào)CGMCC3765或粘膜乳桿菌DH106保藏編號(hào)CGMCC3763。2毒性試驗(yàn)2. 1動(dòng)物及分組取40只SPF級(jí)別小鼠，6 8周齡，體重15 19g，隨機(jī)分入粘膜乳桿菌DH103組、粘膜乳桿菌DH105組、粘膜乳桿菌DH106菌和未給藥組，每組10只。2. 2制備菌液將上述不同的粘膜乳桿菌菌粉分別用純化水調(diào)制為含菌數(shù)均為 1 X 109CFU/mL 的菌液。2. 3方法各粘膜乳桿菌組和未給藥組均給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一致，各粘膜乳桿菌組每天灌服粘膜乳桿菌菌液0. 5mL，未給藥組每天灌服純化水0. 5mL，飼喂6個(gè)月，觀察體重及毒性反應(yīng)。2. 4 結(jié)果各組小鼠均未出現(xiàn)異常情況，未發(fā)生振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、姿態(tài)異常，無眼球突出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無死亡情況，且各粘膜乳桿菌組的體重增加顯著高于未給藥組(P<0. 05)，表明粘膜乳桿菌菌種有促進(jìn)生長發(fā)育作用，說明效果良好，未見中毒反應(yīng)。3制備成粉劑等劑型根據(jù)上述步驟和方法分離鑒定后，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)無毒性，就可將粘膜乳桿菌菌種制成菌粉，然后按照需要添加相關(guān)輔料制成各種劑型，優(yōu)選據(jù)粘膜乳桿菌菌粉的活菌數(shù)，按比例添加淀粉制成粉劑，使活菌數(shù)不低于ι χ 109CFU/g,然后裝袋。制備實(shí)施例2嗜酸乳桿菌菌粉的制備為進(jìn)一步說明本發(fā)明的新穎性和創(chuàng)造性，在應(yīng)用效果實(shí)施例中用嗜酸乳桿菌做對(duì)
5照研究。其中選用的嗜酸乳桿菌為嗜酸乳桿菌DF96106保藏編號(hào)CGMCC0313. 4。嗜酸乳桿菌菌粉的制備培養(yǎng)基為(培養(yǎng)基不限于本發(fā)明所述的，公知的培養(yǎng)基均可以)大豆蛋白胨(國產(chǎn))5g，胰胨(Tryptone) 5g，酵母提取物5g，肉膏10g, K2HPO4 IOg,檸檬酸二銨2g，乙酸鈉 5g,葡萄糖 20g，吐溫 80 1. OmL, MgSO4 · 7H20 4. 8g，MnSO4. 4Η200· 05g，蒸餾水 1000M1,調(diào) PH6. 2-6.4，121°C滅菌15分鐘。將嗜酸乳桿菌DF96106接種到上述培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37°C下擴(kuò)增培養(yǎng)96小時(shí)。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)為lX109CFU/g以上。應(yīng)用效果實(shí)施例說明本發(fā)明以粘膜乳桿菌DH103保藏編號(hào)CGMCC3766、粘膜乳桿菌DH105保藏編號(hào)CGMCC3765或粘膜乳桿菌DH106保藏編號(hào)CGMCC3763為代表說明粘膜乳桿菌的應(yīng)用效果。應(yīng)用效果實(shí)施例1 粘膜乳桿菌在豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用1材料與方法1. 1 材料1.1.1試驗(yàn)產(chǎn)品粘膜乳桿菌活菌粉劑，嗜酸乳桿菌活菌粉劑，活菌數(shù)均為1 X 109CFU/g以上。1. 1.2 試驗(yàn)豬選擇30日齡的斷奶健康仔豬150頭(公母各半)，隨機(jī)分為5組，每組30頭。1.2 方法1. 2. 1試驗(yàn)時(shí)間為30天。1. 2. 2該試驗(yàn)采取干料飼喂，試驗(yàn)組每噸飼料添加試驗(yàn)產(chǎn)品1000克，嗜酸乳桿菌組每噸飼料添加嗜酸乳桿菌活菌粉劑1000克，對(duì)照組不加試驗(yàn)產(chǎn)品。2試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組斷奶仔豬的日增重、日采食量、料重比、死淘率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 粘膜乳桿菌各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P > 0. 05)，粘膜乳桿菌與嗜酸乳桿菌和對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0. 05)，嗜酸乳桿菌與對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P > 0. 05)。見表1、2.表1不同處理組斷奶仔豬的生長表現(xiàn)
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于豬、雞養(yǎng)殖的制劑，其特征在于該制劑由粘膜乳桿菌制成。
2.按權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于促進(jìn)豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉(zhuǎn)化率。
3.按權(quán)利要求1所述制劑，其特征在于包括獸藥或飼料添加劑。
4.按權(quán)利要求1所述粘膜乳桿菌，其特征在于粘膜乳桿菌指活的生物個(gè)體。
5.按權(quán)利要求1所述粘膜乳桿菌，其特征在于包括粘膜乳桿菌DH103保藏編號(hào)CGMCC 3766。
6.按權(quán)利要求1所述粘膜乳桿菌，其特征在于包括粘膜乳桿菌DH105保藏編號(hào)CGMCC 3765。
7.按權(quán)利要求1所述粘膜乳桿菌，其特征在于包括粘膜乳桿菌DH106保藏編號(hào)CGMCC 3763。
8.按權(quán)利要求1所述制劑，其特征在于固體制劑包含的總活菌數(shù)不低于IX106CFU/g， 一般在1 X 109CFU/g以上，最高可達(dá)到1 X 10nCFU/g或1 X 10nCFU/g以上；或液體制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1 X 106CFU/mL, 一般在1 X 109CFU/mL以上，最高可達(dá)到1 X 10nCFU/mL 或 ι χ IoiiCfuAiL 以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于豬、雞養(yǎng)殖的制劑，具體是由粘膜乳桿菌制成的制劑在促進(jìn)豬、雞的生長，防治豬、雞疾病或提高飼料轉(zhuǎn)化率中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A23K1/18GK102239963SQ20101018308
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月12日
發(fā)明者崔云龍, 李洪福 申請(qǐng)人:青島東海藥業(yè)有限公司