專利名稱：一種抗菌納米銀溶膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌納米銀溶膠的制備方法。
背景技術(shù)：
銀及銀化合物的抗菌應(yīng)用已經(jīng)有很長的歷史了，可是直到20世紀初人們才發(fā)現(xiàn) 銀膠體的抗菌活性?？股仡愃幬锏陌l(fā)現(xiàn)一度使該領(lǐng)域的發(fā)展陷入停滯狀態(tài)，然而隨著病 原微生物對抗生素耐藥性的不斷增強，人們又重新開始關(guān)注銀膠體的生物效應(yīng)。納米銀膠 體對某些菌株的抗菌效果可以與抗生素相媲美。目前，納米銀已經(jīng)成功應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)、抗 菌織物等實驗研究。此外，納米銀在環(huán)境保護、紡織服飾、水果保鮮和食品衛(wèi)生領(lǐng)域也有廣 泛的應(yīng)用。 納米銀的抗菌作用機制還不是很明確，迄今為止，有多種機制用來解釋納米銀 的抗菌特性(l)納米銀吸附到細胞膜表面改變細胞膜的特性。納米銀顆?？梢允怪?糖分子降解，通過形成凹陷在細胞膜內(nèi)側(cè)聚積，最終導(dǎo)致細胞膜的滲透性崩解(Sondi， I.等，2004， J. Coll. Inter. Sci. 275 (1) ， 177-182) 。 (2)納米銀顆粒穿透進入細菌細胞造 成DNA損傷，阻止DNA的復(fù)制。(3)納米銀溶解釋放出抗菌銀離子，銀離子可以與細菌蛋 白質(zhì)中的巰基相互作用，導(dǎo)致呼吸酶的失活和活性氧的產(chǎn)生。(Morones， J.R.等，2005， Nanotechnology， 16 (10) ， 2346-2353)。納米銀溶膠的抗菌性能與納米銀的粒徑大小、均一 程度、濃度及穩(wěn)定性等具有直接關(guān)系。利用化學還原法制備納米銀，常用的還原劑有檸檬酸 鈉、葡萄糖、多元醇、過氧化氫、硼氫化物、水合肼等。已有研究表明，使用強還原劑(如硼氫 化物)可以在一定程度上形成小的單分散顆粒，但是反應(yīng)中大顆粒的產(chǎn)生卻難以控制。弱 還原劑(如檸檬酸鹽)的使用可以減緩反應(yīng)速率，但是顆粒的分散度卻比較差。有機還原劑 進行熱還原的方法簡單，但是所制備的納米銀溶膠穩(wěn)定性不好。Siddhartha Shrivastava 等利用葡萄糖和水合肼組成的混和還原劑來還原制備納米銀，通過提高納米銀的穩(wěn)定性而 增強了其抗菌能力(SiddharthaShrivastava等，2007， Nanotechnology, 18 :225103)。但是 從其文章中的結(jié)果來看，所制備的納米銀溶膠分散性較差，且粒徑分布不夠均一。
納米銀用于治療應(yīng)用，其穩(wěn)定性是一個重要問題。先前的研究表明，納米銀顆粒在 溶液中是不穩(wěn)定的，當它的平均粒徑大于40nm或在高濃度狀態(tài)下就容易發(fā)生聚集。通過 對納米銀進行修飾來提高其抗菌性能的研究也早有報道，主要的修飾劑包括表面活性劑、 SDS、吐溫80、聚合物、PVP360等。經(jīng)過SDS修飾的納米銀的抗菌活性明顯加強，而利用吐溫 80修飾的納米銀的抗菌性能卻沒有明顯改變。SDS對納米銀的穩(wěn)定作用比吐溫80要好，因 此其抗菌性能更強。另外，SDS是一種離子型表面活性劑，可以滲透或破壞細胞壁尤其是對 革蘭氏陽性菌。相反，土溫80是非離子型表面活性劑，不能與細菌的細胞壁發(fā)生作用。對于 PVP修飾的納米銀顆粒，其抗菌性能改善是明顯的，因為聚合物對納米銀的穩(wěn)定作用是最好 的。但是這些高分子修飾劑或保護劑很難滿足綠色生產(chǎn)的要求，而且還可能會對人體產(chǎn)生 毒害作用。 中國發(fā)明專利CN1653907A公開的以高聚物為穩(wěn)定劑的納米銀溶液和納米銀粉的 制備方法，成功地以淀粉、殼聚糖、纖維素衍生物等為穩(wěn)定劑進行了納米銀溶液的制備。但
3是這些高聚物有的水溶性較差，對納米銀的保護作用有限，因此無法合成較高濃度的納米 銀溶膠。而且有研究表明，淀粉與納米銀顆粒之間的粘合作用是比較弱的，在較高溫度下可 以發(fā)生可逆轉(zhuǎn)變使合成顆粒分離。 中國發(fā)明專利CN1903946A公開的一種高分散納米銀顆粒的制備方法，它以多元 醇為還原劑及溶劑在高分子保護劑存在的情況下還原制得高分散的納米銀顆粒。但實驗研 究發(fā)現(xiàn)，其制備的納米銀的穩(wěn)定性較差，放置一段時間后納米銀溶膠中會有黑色粉狀沉淀產(chǎn)生。 從納米銀的研究應(yīng)用來看，我們有必要尋找一種優(yōu)良的、可靠的納米銀合成方法， 提高納米銀溶膠的均一性和穩(wěn)定性，增強納米銀的抗菌性能，以滿足人們對納米銀的各種
應(yīng)用需求。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗菌納米銀溶膠的制備方法。本方法制備的納米銀溶膠
具有高濃度、高穩(wěn)定、高分散性，而且其抗菌性也有明顯增強。 —種高效抗菌納米銀溶膠的制備方法，按照如下操作步驟進行 (1)將水溶性保護劑溶于濃度為O. 001mol/L 0. lmol/L的硝酸銀水溶液中，混合
均勻后備用，其中，水溶性保護劑與硝酸銀的質(zhì)量比為0. 5 10. 0 : 1 ; (2)將濃度為0. 001mol/L 0. 2mol/L的硼氫化鈉水溶液冰浴10 30分鐘； (3)將步驟(1)中含有水溶性保護劑的硝酸銀水溶液滴入冰浴后的硼氫化鈉水溶
液中，滴速為30 60滴/分鐘，同時用磁力攪拌器加以攪拌，待滴加完后繼續(xù)攪拌20 40
分鐘，即得本發(fā)明的納米銀溶膠，其中，硼氫化鈉與硝酸銀的摩爾比為1.0 30.0 : 1。 所述的磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為500 2000轉(zhuǎn)/分鐘。 所述的水溶性保護劑為葡聚糖，或葡聚糖與聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇 (PVA)、檸檬酸鈉和明膠中的一種或多種的混合物。 所述葡聚糖在水溶性保護劑中所占的質(zhì)量百分比不少于20%。
本發(fā)明中使用的水溶性保護劑以葡聚糖為主，同時還可輔以其它水溶性保護劑。 葡聚糖是一種低聚糖，與其它多糖類相比具有很好的水溶性，而且能抵抗過濾性病毒、真 菌、細菌等引起的感染，因此葡聚糖具有廣闊的醫(yī)學應(yīng)用前景。葡聚糖在納米銀形成過程中 發(fā)揮了很好的保護作用，大大提高了納米銀溶膠的穩(wěn)定性和分散性，與此同時葡聚糖所具 有的生理活性有助于提高納米銀的生物效能。經(jīng)過比較，本發(fā)明使用了效果最為理想的強 還原劑硼氫化鈉，并通過冰浴的方式來控制其反應(yīng)速率，以免反應(yīng)過快而使納米銀顆粒發(fā) 生聚沉。另外，本發(fā)明可以通過調(diào)節(jié)保護劑的配比、反應(yīng)物的濃度以及反應(yīng)物的摩爾比來控 制納米銀顆粒的大小和納米銀溶膠的濃度。最終可制得粒徑為5 80nm的納米銀溶膠。
本發(fā)明不僅具有操作簡單、生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)率高等特點，而且所制備的納 米銀溶膠既可以作為普通的消毒劑使用，也可以用于生產(chǎn)醫(yī)用抗菌抗病毒產(chǎn)品，應(yīng)用廣泛。 本發(fā)明所制備的納米銀溶膠能夠達到較高濃度1500卯m(1500iig/mL)而不會發(fā)生聚沉，而 納米銀單體在水中的極限濃度為600卯m，濃度再大就出現(xiàn)過飽和或者沉淀等分散不均勻的 現(xiàn)象。本發(fā)明所制備的納米銀粒徑小且尺寸分布均一，可以穩(wěn)定保存三個月以上，抗菌能力 大大增強。該生產(chǎn)工藝沒有使用任何有毒或有害的化學試劑，完全達到了綠色生產(chǎn)的目的。
4
圖1納米銀溶膠透射電鏡圖； (a)實施例2制得的納米銀溶膠透射電鏡圖；放大12. 5萬倍(125kX) (b)實施例3制得的納米銀溶膠透射電鏡圖；放大12. 5萬倍(125kX) 圖2實施例4制得的納米銀溶膠的紫外_可見吸收光譜圖； 圖3實施例9制得的納米銀溶膠的抗菌效果實驗圖。 (a) PBS組大腸桿菌生長情況 (b)市售納米銀組大腸桿菌生長情況 (c)本發(fā)明納米銀組大腸桿菌生長情況
具體實施例方式
通過以下實施例對本發(fā)明做詳細描述，但是以下實施例僅僅是作為例證，并不對 本發(fā)明構(gòu)成任何限制。實施例1-8為本發(fā)明的制備例，實施例9為抗菌效果實驗。
實施例1 (1)稱取O. 0085g硝酸銀用去離子水配制50ml濃度為0. 001M的硝酸銀水溶液，然 后取0.0085g葡聚糖溶于上述硝酸銀水溶液(葡聚糖與硝酸銀的質(zhì)量比為1 : l)，緩慢攪 拌備用； (2)稱取0. 0189g硼氫化鈉用去離子水配制250ml濃度為0. 002M的硼氫化鈉水溶 液，冰浴20min ; (3)將步驟(1)的含葡聚糖的硝酸銀水溶液逐滴加入到冰浴下的硼氫化鈉水溶液 中，滴速為60滴/分鐘，同時使用磁力攪拌器加以劇烈攪拌，轉(zhuǎn)速為500轉(zhuǎn)/分鐘；
(4)待滴加完后繼續(xù)攪拌20min使其充分反應(yīng)。 最終制得亮黃色納米銀溶膠，納米銀顆粒的平均粒徑為16nm，粒徑分布集中在 12 21nm之間。
實施例2 (1)稱取O. 085g硝酸銀用去離子水配制50ml濃度為0. 01M的硝酸銀水溶液，然后 取0.085g葡聚糖溶于上述硝酸銀水溶液(葡聚糖與硝酸銀的質(zhì)量比為l : l)，緩慢攪拌備 用； (2)稱取0. 189g硼氫化鈉用去離子水配制250ml濃度為0. 02M的硼氫化鈉水溶 液，冰浴30min ; (3)將步驟(1)的含葡聚糖的硝酸銀水溶液逐滴加入到冰浴下的硼氫化鈉水溶液 中，滴速為45滴/分鐘，同時使用磁力攪拌器加以劇烈攪拌，轉(zhuǎn)速為800轉(zhuǎn)/分鐘；
(4)待滴加完后繼續(xù)攪拌30min使其充分反應(yīng)。 最終制得紅黑色納米銀溶膠，納米銀顆粒的平均粒徑為10nm，且粒徑分布十分均 一，見圖l(a)。
實施例3 (1)稱取O. 17g硝酸銀用去離子水配制100ml濃度為0.01M的硝酸銀水溶液，然后 取0. 085g葡聚糖和0. 085gPVP混溶于上述硝酸銀水溶液(葡聚糖/PVP混合保護劑與硝酸銀的質(zhì)量比為l : l)，緩慢攪拌備用； (2)稱取0. 378g硼氫化鈉用去離子水配制500ml濃度為0. 02M的硼氫化鈉水溶 液，冰浴30min ; (3)將步驟(1)的含葡聚糖/PVP保護劑的硝酸銀水溶液逐滴加入到冰浴下的硼氫 化鈉水溶液中，滴速為45滴/分鐘，同時使用磁力攪拌器加以劇烈攪拌，轉(zhuǎn)速為800轉(zhuǎn)/分 鐘； (4)待滴加完后繼續(xù)攪拌30min使其充分反應(yīng)。 最終制得紅黑色納米銀溶膠，納米銀顆粒的平均粒徑為5nm，粒徑分布比較均一。 從
圖1(b)中可以看出顆粒濃度明顯增大。
實施例4 (1)稱取0.085g硝酸銀用去離子水配制100ml濃度為0.005M的硝酸銀水溶液，然 后取0.425g葡聚糖溶于上述硝酸銀水溶液(葡聚糖與硝酸銀的質(zhì)量比為5 : l)，緩慢攪拌 備用； (2)稱取0. 189g硼氫化鈉用去離子水配制250ml濃度為0. 02M的硼氫化鈉水溶 液，冰浴20min ; (3)將步驟(1)的含葡聚糖的硝酸銀水溶液逐滴加入到冰浴下的硼氫化鈉水溶液 中，滴速為40滴/分鐘，同時使用磁力攪拌器加以劇烈攪拌，轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘；
(4)待滴加完后繼續(xù)攪拌30min使其充分反應(yīng)。 最終制得均一穩(wěn)定的紅棕色納米銀溶膠，納米銀顆粒的平均粒徑為8nm。用紫 外-可見分光光度計對其進行檢測，納米銀溶膠在395nm處有其最大吸收峰，而且吸收峰的 坡度比較陡，見圖2。結(jié)果表明，銀離子被還原生成了納米銀，而且納米銀的粒徑分布比較均 實施例5 (1)稱取O. 085g硝酸銀用去離子水配制50ml濃度為0. 01M的硝酸銀水溶液，然后 取0. 0425g葡聚糖和0. 085gPVA混溶于上述硝酸銀水溶液(葡聚糖/PVA保護劑與硝酸銀 的質(zhì)量比為3 : 2)，緩慢攪拌備用； (2)稱取0. 189g硼氫化鈉用去離子水配制250ml濃度為0. 02M的硼氫化鈉水溶 液，冰浴30min ; (3)將步驟(1)的含葡聚糖/PVA保護劑的硝酸銀水溶液逐滴加入到冰浴下的硼 氫化鈉水溶液中，滴速為30滴/分鐘，同時使用磁力攪拌器加以劇烈攪拌，轉(zhuǎn)速為1200轉(zhuǎn) /分鐘; (4)待滴加完后繼續(xù)攪拌30min使其充分反應(yīng)。 最終制得灰黑色納米銀溶膠，納米銀顆粒的平均粒徑為25nm。 實施例6 (1)稱取O. 085g硝酸銀用去離子水配制25ml濃度為0. 02M的硝酸銀水溶液，然后 取0.255g葡聚糖溶于上述硝酸銀水溶液(葡聚糖與硝酸銀的質(zhì)量比為3 : l)，緩慢攪拌備 用； (2)稱取0. 4725g硼氫化鈉用去離子水配制250ml濃度為0. 05M的硼氫化鈉水溶 液，冰浴30min ;
(3)將步驟(1)的含葡聚糖的硝酸銀水溶液逐滴加入到冰浴下的硼氫化鈉水溶液
中，滴速為30滴/分鐘，同時使用磁力攪拌器加以劇烈攪拌，轉(zhuǎn)速為1200轉(zhuǎn)/分鐘； (4)待滴加完后繼續(xù)攪拌30min使其充分反應(yīng)。 最終制得紅褐色納米銀溶膠，納米銀顆粒的平均粒徑為20nm。 實施例7 (1)稱取O. 425g硝酸銀用去離子水配制50ml濃度為0. 05M的硝酸銀水溶液，然后 取0. 85g葡聚糖和0. 85g明膠混溶于上述硝酸銀水溶液(葡聚糖/明膠與硝酸銀的質(zhì)量比 為4 : l)，緩慢攪拌備用； (2)稱取1. 89g硼氫化鈉用去離子水配制1000ml濃度為0. 05M的硼氫化鈉水溶 液，冰浴30min ; (3)將步驟(1)的含葡聚糖/明膠的硝酸銀水溶液逐滴加入到冰浴下的硼氫化鈉
水溶液中，滴速為30滴/分鐘，同時使用磁力攪拌器加以劇烈攪拌，轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘； (4)待滴加完后繼續(xù)攪拌30min使其充分反應(yīng)。 最終制得紫黑色納米銀溶膠，納米銀顆粒的平均粒徑為30nm。 實施例8 (1)稱取0. 85g硝酸銀用去離子水配制50ml濃度為0. 1M的硝酸銀水溶液，然后 取8.5g葡聚糖溶于上述硝酸銀水溶液(葡聚糖與硝酸銀的質(zhì)量比為10 : l)，緩慢攪拌備 用； (2)稱取1. 89g硼氫化鈉用去離子水配制1000ml濃度為0. 05M的硼氫化鈉水溶 液，冰浴30min ; (3)將步驟(1)的含葡聚糖的硝酸銀水溶液逐滴加入到冰浴下的硼氫化鈉水溶液
中，滴速為30滴/分鐘，同時使用磁力攪拌器加以劇烈攪拌，轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘； (4)待滴加完后繼續(xù)攪拌40min使其充分反應(yīng)。 最終制得黑色納米銀溶膠，納米銀顆粒的平均粒徑為10nm。 實施例9本發(fā)明納米銀溶膠的抗菌效果實驗 (1)按照實施例4制備納米銀溶膠； (2)用無菌生理鹽水將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌(由軍事醫(yī)學科
學院提供)進行適當稀釋，分別制備成含菌量為104cfu/mL的菌懸液； (3)將PBS緩沖液、市售納米銀抗菌液(180 220ppm，購自武漢滬正納米科技有
限公司)和自制的納米銀溶膠(約為200卯m)分為三個實驗組，各取100iU加入到不同的
EP管中，然后將步驟(1)制備的菌懸液30ia分別加入到不同的EP管中混勻； (4)待15min后，將各混合液分別接種到營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基表面并涂布均勻； (5)將涂好的各平板倒置于37t:恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24h后觀察平板上的細
菌生長情況。 結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的納米銀溶膠具有高效的抗菌性能。圖3(a)為PBS對照 組的大腸桿菌的生長情況，菌落幾乎長滿整個平板；圖3(b)為市售納米銀組的大腸桿菌的 生長情況，菌落受到一定程度抑制，但是仍有大量細菌生長；圖3(c)為本發(fā)明納米銀組的
大腸桿菌的生長情況，菌落完全被抑制，只是在平板的周邊存在零星小菌落。
參考文獻
7
1. Sondi，I. ，Salopek-Sondi，B. ，2004. Silver nanoparticles as antimicrobial agent :a case study onE. coli as a model for gram—negative bacteria. J. Coll. Inter. Sci. 275(1) ，177-182. 2. Morones， J. R. ， Elechiguerra， J. L. ， Camacho， A. ， Holt， K. ， Kouri， J. B. ， Ramirez, J. T. ， Yacaman， M. J. ， 2005.The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology 16 (10)， 2346-2353. 3. Siddhartha Shrivastava， Tanmay Bera， Gajendra Singh， P Ramachandrarao 肌d DebabrateDash,2007. Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles. Nanotechnology 18 (2007)225103 (9pp).
8
權(quán)利要求
一種抗菌納米銀溶膠的制備方法，其特征在于，按照如下操作步驟進行(1)將水溶性保護劑溶于濃度為0.001mol/L～0.1mol/L的硝酸銀水溶液中，混合均勻后備用，其中，水溶性保護劑與硝酸銀的質(zhì)量比為0.5～10.0∶1；(2)將濃度為0.001mol/L～0.2mol/L的硼氫化鈉水溶液冰浴10～30分鐘；(3)將步驟(1)中含有水溶性保護劑的硝酸銀水溶液滴入冰浴后的硼氫化鈉水溶液中，滴速為30～60滴/分鐘，同時用磁力攪拌器加以攪拌，待滴加完后繼續(xù)攪拌20～40分鐘，即得納米銀溶膠，其中，硼氫化鈉與硝酸銀的摩爾比為1.0～30.0∶1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌納米銀溶膠的制備方法，其特征在于，所述的磁力攪拌 器的轉(zhuǎn)速為500 2000轉(zhuǎn)/分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌納米銀溶膠的制備方法，其特征在于，所述的水溶性保 護劑為葡聚糖，或葡聚糖與聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、檸檬酸鈉和明膠中的一種或多種的 混合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌納米銀溶膠的制備方法，其特征在于，所述葡聚糖在水 溶性保護劑中所占的質(zhì)量百分比不少于20%。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物納米材料技術(shù)領(lǐng)域的一種抗菌納米銀溶膠的制備方法。該方法采用化學還原法，將水溶性保護劑溶于濃度為0.001mol/L～0.1mol/L的硝酸銀水溶液中，其中，保護劑與硝酸銀的質(zhì)量比為0.5～10.0∶1，同時將濃度為0.001mol/L～0.2mol/L的硼氫化鈉水溶液冰浴10～30分鐘；然后將含有保護劑的硝酸銀水溶液滴入冰浴后的硼氫化鈉水溶液中，滴速為30～60滴/分鐘，同時用磁力攪拌器加以攪拌，待滴加完后繼續(xù)攪拌20～40分鐘，可制得粒徑為5～80nm的納米銀溶膠，其中，硼氫化鈉與硝酸銀的摩爾比為1.0～30.0∶1。本發(fā)明制備的納米銀溶膠具有高濃度、高穩(wěn)定、高分散性，而且其抗菌性能也有明顯增強。
文檔編號A01P1/00GK101731272SQ200910243798
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者楊桂利, 王常勇 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所