專利名稱：：一種用于防治煙葉倉庫害蟲的生防菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于防治煙葉倉庫害蟲的生防菌劑，屬微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：煙草粉螟&力e"J'ae7"e7/a(H他ner)，屬鱗翅目螟蛾科。在煙葉倉庫害蟲中是僅次于煙草甲的倉貯害蟲。煙草粉螟廣泛分布于世界熱帶及溫帶地區(qū)，國內(nèi)分布于遼寧、甘肅、云南、貴州、四川、湖南、湖北、河南及江蘇等地。在云南，煙葉倉庫害蟲以煙草粉螟為害最重，資料統(tǒng)計(jì)表明，每年因這種害蟲造成的貯煙量損失占總貯量的0.5%1%。煙草粉螟以幼蟲危害煙葉，成蟲不吃食物。幼蟲喜吃含糖高、尼古丁低的烤煙和香料煙。目前，防治煙葉倉庫害蟲主要應(yīng)用熏蒸劑(如磷化鋁)薰蒸。但是近年來，國內(nèi)外對環(huán)境保護(hù)日益重視，要求減少和禁止使用劇毒薰蒸劑的呼聲高漲，氰化氫、溴甲垸、磷化鋁等已相繼被禁用，在煙葉倉庫中使用磷化鋁，由于操作不當(dāng)易造成火災(zāi)，且倉庫需要良好的密封性能。由于人類對環(huán)境保護(hù)及自身健康意識的增強(qiáng)，生物防治已成為人們研究的熱點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種使用安全、煙葉及環(huán)境污染低的用于防治煙葉倉庫害蟲的生防菌劑，為煙葉的貯存提供技術(shù)支持。本發(fā)明采用的是蘇云金桿菌幕蟲亞種feeii^As^/r//^ie/7s/s5""AA/Y/j'"鵬s菌株IO，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院；保藏日期2009年2月6日；保藏登記入冊的編號CGMCCNO.2896。菌株10屬于蘇云金桿菌，系本發(fā)明人從大量復(fù)烤煙葉里分離出的蘇云金桿菌中篩選出來的，對煙草粉螟具有較好防治效果。本發(fā)明人通過13項(xiàng)生理生化試驗(yàn)結(jié)果與已知的29個(gè)蘇云金桿菌亞種的生理生化指標(biāo)比較，鑒定為科爾默亞種/Y/i"邁M，血清型H2。本發(fā)明的生物菌劑經(jīng)如下工藝制成-試管種子培養(yǎng)將菌株10接種到試管斜面培養(yǎng)基上，試管斜面培養(yǎng)基(重量百分比)配方為牛肉膏5%，蛋白胨1.0%，瓊脂2.0%，氯化鈉O.5%，p朋.0;3(TC恒溫培養(yǎng)2天，獲得試管種子；液體發(fā)酵采用試管培養(yǎng)的蘇云金桿菌菌株10原種，按試管原種—三角搖瓶—發(fā)酵罐的三級工藝培養(yǎng)。在30L發(fā)酵罐中，裝入20L液體發(fā)酵培養(yǎng)液，液體培養(yǎng)基(重量百分比)配方為玉米粉'0.5%、黃豆粉2.0%、酵母粉0.10%、蛋白胨0.075%、磷酸二氫鉀.0.75%、碳酸鈣0.15%和硫酸鎂0.035%，0.025%植物油作消泡劑，初始pH值為7.5。經(jīng)0.05mpa滅菌30分鐘，冷卻至室溫接入1.8L菌株10液體種子，接種量為9%(體積比)，發(fā)酵溫度為3(TC，通氣量為15%(體積比)，攪拌速度為150r/min，發(fā)酵時(shí)間為36h。制備生防菌劑將經(jīng)液體發(fā)酵后的培養(yǎng)液在5"C下，用高速離心機(jī)5000g離心20分鐘，去除上清液—離心后的沉淀物用凍干超濾儀在室溫下凍干4粉碎成粉直接作為殺蟲劑使用，制成的菌粉活芽孢數(shù)1.44xl()W個(gè)/ml。本發(fā)明的生防菌劑具有使用安全、煙葉及環(huán)境污染低的優(yōu)點(diǎn)，能廣泛用于煙葉貯存?zhèn)}庫中害蟲的生防。具體實(shí)施例方式一、生防菌劑的制備本發(fā)明的生物菌劑經(jīng)如下工藝制成試管種子培養(yǎng)將菌株10接種到試管斜面培養(yǎng)基上，試管斜面培養(yǎng)基(重量百分比)配方為牛肉膏5%，蛋白胨1.0%，瓊脂2.0%，氯化鈉0.5%，pH8.0;3(TC恒溫培養(yǎng)2天，獲得試管種子；液體發(fā)酵采用試管培養(yǎng)的蘇云金桿菌菌株10原種，按三角搖瓶—種子罐—發(fā)酵罐的三級工藝培養(yǎng)。在30L發(fā)酵罐中，裝入20L液體發(fā)酵培養(yǎng)液，液體培養(yǎng)基(重量百分比)配方為玉米粉0.5%、黃豆粉2.0%、酵母粉0.10%、蛋白胨0.075%、磷酸二氫鉀0.75%、碳酸鈣0.15Vo和硫酸鎂0.035%，0.025%植物油作消泡劑，初始pH值為7.5。經(jīng)0.05mpa滅菌30分鐘，冷卻至室溫接入1.8L菌株10液體種子(接種量為9%)，發(fā)酵溫度為30"C，通氣量為15%，攪拌速度為150r/min，發(fā)酵時(shí)間為36h。二、本發(fā)明生防菌劑防治煙草粉螟的功能試驗(yàn)1、菌株10對幼蟲生長發(fā)育的影響設(shè)IOO、200、300倍三個(gè)濃度。以噴無菌水為對照。噴(菌)液量為20nl/g菌劑處理煙葉后置于養(yǎng)蟲室，溫濕度為自然溫濕度。每試驗(yàn)濃度接蟲15頭，三次重復(fù)。試驗(yàn)處理后7天調(diào)査煙草粉螟的死亡情況。從表l可知菌株IO的IOO、200、300倍對一至五齡煙草粉螟幼蟲的防治效果均在98%以上，平均防治效果均在99.49%以上。表l菌株10對煙草粉螟的防治效果處理試驗(yàn)前接蟲數(shù)(頭)-齡死亡數(shù)二齡三齡四齡五齡防效死亡數(shù)(頭)(％)(頭)防效(%)f防效f防效f(頭)(％)(頭)(％)(頭)一至五齡平均防效(%)防效(%)菌株10-10045451004510045100451004292.3198.470454510045100451004510045100100.00倍CK454510045100451004510045100100.0045399362、菌株10小批量防治煙草粉螟試驗(yàn)2.1材料與方法無蟲復(fù)烤煙葉等級為云南玉溪中部桔黃二級C2F煙葉；有蟲復(fù)烤煙葉為云南昭通中部桔黃二級C2F煙葉。設(shè)100、200、300倍三個(gè)濃度，三次重復(fù)。以噴無菌水為對照。試驗(yàn)重復(fù)設(shè)置如表2。每小區(qū)4kg煙葉，噴(菌)液量為20ml/kg菌劑處理后置于玉溪煙廠第一煙葉庫區(qū)11號試驗(yàn)倉庫，溫濕度為自然溫濕度。試驗(yàn)處理后20天調(diào)查蟲情。防治效果計(jì)算公式無蟲復(fù)烤煙葉組防治效果=對照試驗(yàn)組-處理試驗(yàn)組對照試驗(yàn)組xlOO%有蟲復(fù)烤煙葉組(試驗(yàn)后對照組基數(shù)-試驗(yàn)前對照組基數(shù))-(處理試驗(yàn)組-試驗(yàn)前對照組基數(shù))防治效果-_X100%試驗(yàn)后對照組基數(shù)-試驗(yàn)前對照組基數(shù)表2試驗(yàn)重復(fù)設(shè)置菌株濃麼f倍)無蟲復(fù)烤煙葉組有蟲復(fù)烤煙w叉、l口/IIIm葉組菌株10100W33-100-lW33-100-2W33-100-3Y33掘菌株10200W33-200-lW33-200-2W33-200-3Y33-200菌株10300W33-300-lW33-300-2W33-300-3Y33-300CKWCK-1WCK-2WCK-3YCK2.2結(jié)果與分析倍賴J倍賴g菌s菌s152.2.1對無蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果由表3可知菌株10對無蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果100是84.07%;200倍是65.49%;300倍是44.280/。。表3菌株10對無蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果菌株濃度(倍)無蟲復(fù)烤煙葉組(頭)防治效果(%)IIIin合計(jì)菌株10100122043684.07菌株102003115327865.49菌株1030055422912644.28CK7877712262.2.2對有蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果由表4可知菌株10對有蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果100倍是91.43%;200倍是80.00%;300倍分別是77.14%。表4菌株10對有蟲復(fù)烤煙葉組的防治效果菌株濃度(倍)有蟲復(fù)烤煙葉組(頭)防治效果(％)Bt33100591.43Bt33200980.00Bt333001077.14CK試驗(yàn)前2CK試驗(yàn)后373菌株10在煙葉倉庫中的防治效果試驗(yàn)3.1材料與方法試驗(yàn)地點(diǎn)為云南玉溪、楚雄煙廠煙葉倉庫；煙葉等級為上部桔黃二級B2F;菌劑施用方法(1)、煙葉均勻噴霧，菌劑0.1g/lkg煙葉+無菌水5ml/lkg煙葉；(2)、煙包表面噴霧，0.2g/lkg煙葉+無菌水5ml/lkg。煙葉噴菌劑后按常規(guī)打包煙葉倉庫存貯。施藥后3、6、12個(gè)月定期調(diào)査蟲害發(fā)生情況。3.2結(jié)果與分析從表5中可知噴菌劑后3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月玉溪、楚雄兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)煙葉均勻噴霧的處理均未遭到蟲害，防治效果較好；煙包表面噴霧處理除玉溪點(diǎn)12個(gè)月的遭到蟲害外，其余均未遭到蟲害，防治效果也較好。總之，菌株10的菌劑兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)煙葉均勻噴霧菌劑處理對草粉螟的防治效果較好。_表5菌株10在煙葉倉庫中使用效果評價(jià)_h噴菌劑后噴菌劑后噴菌劑后試驗(yàn)地點(diǎn)處埋3個(gè)月__12個(gè)月噴施菌劑方法蟲情51S防效6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>"-"表示無蟲害發(fā)生；"+"表示有蟲害發(fā)生，"+"號越多表示蟲害越嚴(yán)重。4施用菌劑后對煙葉化學(xué)成分的影響噴菌株10菌劑后3、6、9、12個(gè)月取樣對煙葉進(jìn)行化學(xué)常規(guī)成分分析，各處理總糖、還原糖、總氮、煙堿、蛋白質(zhì)含量與同期CK相比，無明顯影響。說明使用菌株IO防治煙葉倉庫害蟲后對煙葉化學(xué)成分影響不大。(表6)表6噴施菌株10菌劑對煙葉化學(xué)常規(guī)成分的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注數(shù)據(jù)由云南省煙草科學(xué)研究所分析測試中心分析.5施用菌劑對單體煙評吸結(jié)果的影響噴菌劑后12個(gè)月取煙樣進(jìn)行單體煙評吸，結(jié)果見表7。經(jīng)云南煙草研究院產(chǎn)品開發(fā)研究室評吸認(rèn)為2#(菌株IO)樣煙在香氣質(zhì)、香氣量、雜氣方面的品質(zhì)均優(yōu)于4#(CK)樣煙。在刺激性、勁頭、余味方面4支煙較為接近。表7均勻噴霧處理噴菌劑后12個(gè)月的單體煙評吸結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種用于防治煙葉倉庫害蟲的生防菌劑，該生物菌劑由生產(chǎn)菌株經(jīng)試管種子培養(yǎng)、液體發(fā)酵及制備生防菌劑工序得到，其特征在于a.生產(chǎn)菌株為蘇云金桿菌幕蟲亞種(Bacillusthuringiensissubsp.finitimus)菌株10，保藏編號CGMCCNO.2896；b.試管種子培養(yǎng)將菌株10接種到試管斜面培養(yǎng)基上，試管斜面培養(yǎng)基配方為牛肉膏5％，蛋白胨1.0％，瓊脂2.0％，氯化鈉0.5％，pH8.0，配方的比例為重量百分比，30℃恒溫培養(yǎng)2天，獲得試管種子；c.液體發(fā)酵將菌株10種子接種到發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基配方為玉米粉0.5％、黃豆粉2.0％、酵母粉0.10％、蛋白胨0.075％、磷酸二氫鉀0.75％、碳酸鈣0.15％和硫酸鎂0.035％，0.025％植物油作消泡劑，初始pH值為7.5，配方的比例為重量百分比，在發(fā)酵溫度30℃，通氣量15％，攪拌速度150r/min的條件下發(fā)酵36h；d.制備生防菌劑將經(jīng)液體發(fā)酵后的培養(yǎng)液在5℃溫度下，用高速離心機(jī)5000g離心20分鐘，離心后的沉淀物用凍干超濾儀在室溫下凍干，粉碎成粉得到生防菌劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于防治煙葉倉庫害蟲的生防菌劑，屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。該生防菌劑由如下工序制備a.生產(chǎn)菌株為蘇云金桿菌菌株10，CGMCCNO.2896；b.將菌株10接種到牛肉膏5％、蛋白胨1.0％、瓊脂2.0％、氯化鈉0.5％、pH8.0的試管斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)2天，獲得發(fā)酵種子；c.將種子接種到裝有玉米粉0.5％、黃豆粉2.0％、酵母粉0.10％、蛋白胨0.075％、磷酸二氫鉀0.75％、碳酸鈣0.15％和硫酸鎂0.035％，消泡劑0.025％，pH7.5，其余為水的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度30℃，通氣量15％，攪拌速度150r/min的條件下發(fā)酵36h；d.培養(yǎng)液5℃下用離心機(jī)5000g離心20分鐘，沉淀物室溫凍干，粉碎即得生防菌劑。本發(fā)明的生物制劑具有使用安全、煙葉及環(huán)境污染低的優(yōu)點(diǎn)，能夠用于煙葉貯存中煙葉倉庫害蟲煙草粉螟的生物防治。文檔編號A01P7/00GK101558764SQ20091009413公開日2009年10月21日申請日期2009年2月27日優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日發(fā)明者廖文程,李天飛,李文正,鄧云龍,高家合申請人:云南省煙草科學(xué)研究所