專利名稱：：線粒體替代實驗小鼠品系C57BL/6J-Mit<sup>C3H/HeJ</sup>的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬小鼠品系的構(gòu)建領(lǐng)域，特別是涉及線粒體J替代實驗小鼠品系C57BL/6J-MiP目eJ的構(gòu)建。技術(shù)背景哺乳動物的體細胞擁有兩套不同的且相互獨立的基因組，即核基因組和線粒體基因組。在大部分的哺乳動物細胞中，線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)總量占細胞總DNA量的0.1^-1.0%。mtDNA突變在神經(jīng)退行性疾病、衰老和腫瘤等多種生理及病理過程中發(fā)揮重要作用。內(nèi)交系實驗小.鼠C3H/HeJ(C3H)和C57BL/6J(B6)是研究哺乳動物性發(fā)育啟動的調(diào)控機制重要模型動物，因為前者性發(fā)育時間早，后者性發(fā)育時間晚，雌性小鼠的性發(fā)育時間相差5天左右，通過這兩個品系小鼠雜交建立家系，可用來研究小鼠性發(fā)育的遺傳學(xué)調(diào)控機制。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)在用這兩個品系通過正反交建立的雜交Fl代，其性發(fā)育的啟動時間存在明顯差異，而正反交的雜交Fl代核基因組是完全相同的，線粒體只來源于母親，因而是不同的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種線粒體C3H/HeJ替代實驗小鼠品系的構(gòu)建，本發(fā)明的線粒體替換品系可以研究在相同核基因組背景下，由不同的線粒體基因組帶來的性狀差異，是用遺傳學(xué)方法研究線粒體基因組功能的有用工具。本發(fā)明的一種線粒體替代實驗小鼠品系C57BL/6J-MitG^eJ的構(gòu)建，包括(1)回交取C3H/HeJ和C57BL/6J兩種品系的小鼠，以C3H做母本，B6做父本雜交得Fl代；將F1代母鼠與B6雄鼠雜交得C3B61，為回交一代；以此輪回雜交十代，得到回交十代的小鼠C3B61、(2)鑒定回交(a)通過Blast兩品系小鼠的線粒體序列，找到4個SNP位點，以C3H，回交和B6小鼠DNA為模板，進行PCR擴增，再對片段進行測序，鑒定回交小鼠的線粒體DNA，其中上游引物5，—3，ATTCCTTATTGTTTGCCTACT下游引物5，—3，ATATTAGGTGAGAGCGAAAT;(b)從小鼠全基因組中隨機選取40個STR位點，STR位點在C3H/HeJ和C57BL/6J兩個品系中的片斷長度互不相同，并相差2個bp以上，且在每條染色體上分布平均，約1520cM，對40個STR位點進行引物設(shè)計，鑒定回交小鼠的基因組DNA。所述歩驟小鼠購自中科院上海實驗動物中心。所選擇的STR如表3所示。在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)等網(wǎng)站上搜索到C3和B6兩品系小鼠的線粒體的序列信息。從NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)進入小鼠基因組數(shù)據(jù)庫，從中選取小鼠STR(shorttandemrepeat)位點，對這些位點進行引物設(shè)計，主要借助Oligo6.0程序完成。線粒體替代品系將某一近交系小鼠品系的線粒體作為供體，本發(fā)明中供體為C3H小鼠；另一品系作為受體(本發(fā)明中為B6小鼠)，兩個品系雜交后與受體品系回交，通過與輪回親本回交10代后，得到的小鼠細胞中線粒體來源于C3H，核基因組的99.90%跟受體品系是一致的。C3H小鼠和B6小鼠線粒體DNA序列在3個位點上有4個核苷酸差異，涉及3個基因，將C3H小鼠線粒體置換到B6小鼠的核基因組背景上，可以對這些基因的功能進行更全面的研究，以及它們是否參與了某些性狀的調(diào)控。有益效果(1)線粒體替換品系可以研究在相同核基因組背景下，.由不同的線粒體基因組帶來的性狀差異，是用遺傳學(xué)方法研究線粒體基因組功能的有用工具。(2)操作方法簡便，廉價。.圖1回交遺傳效應(yīng)示意2親本(B6,C，3H)和線粒體替換(B6C31Q)小鼠圖圖3C3H、回交、B6的線粒體SNP.位點測序結(jié)果圖圖4小鼠生長曲線具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣羅于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例l:線粒體替換小鼠的構(gòu)建辦法1.回交取C3H和B6兩種品系的成年小鼠，以C3H做母本，B6做父本雜交得Fl代。將Fl代母鼠與B6雄鼠雜交得C3B61，為回交一代。以此輪回雜交十代，得到回交十代的小鼠C3B610。2.線粒體基因組鑒定針對C3H和B6小鼠的線粒體SNP位點設(shè)計一對引物上游引物5，—3，ATTCCTTATTGTTTGCCTACT下游引物5'—3'ATATTAGGTGAGAGCGAAAT以C3H,回交和B6小鼠DNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系表1PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>PCR溫度循環(huán):表2PCR溫度循環(huán)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>將PCR擴增產(chǎn)物測序，序列如圖3所示3.核基因組STR鑒定從NC印(NationalCenterforBiotechnologyInformation)得到這些STR位點的序列，然后對這些STR.位點進行引物設(shè)計。引物設(shè)計主要借助01igo6.Q程序完成。表3本發(fā)明中選定的STR位點<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>D歸1922610D9Mitl66416D10Mit29838D腿it214196D訓(xùn)it29406DllMi細796D12Mit60166D12Mit74296D薩itll0.76D畫it59156D15Mi謹6.712D15Mitl0020.26D16Mitl293.414D薩i麵71.458D17Mi腦21.656D17Mitl2955.710D薩itl83376D腿it21"3554D雇it90416D醒itl3755.710采用多重PCR方案進行擴增，擴增產(chǎn)物用377型測序儀分析。結(jié)果如下表所示:_表4回交小鼠STR各點基因型_遺傳位標DXDXDlDlD2D2D3D3D4D4D5MitMitMitMitMitMitMitMitMitMitMit1401661023610340922122530171367對照B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6回交B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6遺傳位標7D5D7*D7D8D8D9D9D10D10DllDllMitMitMitMitMitMitMitMitMitMitMit28722834612428319216629821429104對照B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6回交B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6遺傳位標D12D12D14D14D15D15D16D16D17D17D18]VtitMit.MitMitMitMitMitMitMitMitMit60741159102100129106104129183對昭"、B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6回交B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6B6遺傳位標D18D19D19MitMitMit21390137對照B6B6B6B6回B6B6B6交實施例2;回交小鼠的生長曲線及性發(fā)育的測定(1)小鼠規(guī)?；亟慌c輪回親本B6小鼠公、母各40只測生長.曲線及性發(fā)育情況。(2)生長曲線的制作8從小鼠出生的隔日開始稱重，并將隔曰的小鼠體重記為第一天體重。之后每隔兩天對小鼠稱重一次，直至35天后小鼠完全成熟?；亟恍∈笈cB6小鼠生長曲線如圖5所示(3)性發(fā)育的測定從斷奶那天開始，每天檢測幼鼠性發(fā)育的情況，觀察雌鼠陰道是否開啟，雄鼠包皮是否分離。并在雌鼠陰道開啟和雄鼠包皮分離的那天稱量體重，記為發(fā)育時體重，及發(fā)育天數(shù)。用SPSS統(tǒng)計軟件，對B6、回交雌鼠陰門開啟年齡、體重、初生體重及雄鼠包皮分離年齡、體重、初生體重進行獨立樣本t檢驗，考察兩組樣本是否有差異。表5雌鼠陰門開啟年齡比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上面表5中可以看出回交的平均陰門開啟年齡與B6的相近。(B6為27.38士1.52天，回交為27.41±1.54天)，且兩樣本差異不顯著(P>0.05)。表6雄鼠包皮分離年齡比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上面表6中可以看出回交的平均包皮分離年齡與B6的相近。(B6為32.23±1.88天，回交為32.22±1.88天)，且兩樣本差異不顯著(P〉0.05)。表7雌鼠發(fā)育體重比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從上面表7中可以看出回交的雌鼠平均發(fā)育體重與B6的相近。(B6為13.13士l,21克，回交為12.77士1.52克)，且商樣本差異不顯著(P>0.05)。表8雄鼠發(fā)育體重比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從上面表8中可以看出回交的雄鼠平均發(fā)育體重與B6的相近。(B6為17.62±1.22克，回交為17.55±1.00克)，且兩樣本差異不顯著(P>0.05)。權(quán)利要求1.線粒體替代實驗小鼠品系C57BL/6J-MitC3H/HeJ的構(gòu)建，包括(1)回交取C3H和B6兩種品系的小鼠，以C3H做母本，B6做父本雜交得F1代；將F1代母鼠與B6雄鼠雜交得C3B61，為回交一代；以此輪回雜交十代，得到回交十代的小鼠C3B610；(2)鑒定回交(a)通過Blast兩品系小鼠的線粒體序列，找到4個SNP位點，以C3H，回交和B6小鼠DNA為模板，進行PCR擴增，再對片段進行測序，鑒定回交小鼠的線粒體DNA，其中上游引物5’→3’ATTCCTTATTGTTTGCCTACT下游引物5’→3’ATATTAGGTGAGAGCGAAAT(b)從小鼠全基因組中隨機選取40個STR位點，STR位點在C3H/HeJ和C57BL/6J兩個品系中的片斷長度互不相同，并相差2個bp以上，且在每條染色體上分布平均，約15～20cM，對40個STR位點進行引物設(shè)計，鑒定回交小鼠的基因組DNA。全文摘要本發(fā)明涉及線粒體替代實驗小鼠品系C57BL/6J-Mit<sup>C3H/HeJ</sup>的構(gòu)建，包括(1)回交取C3H和B6兩種品系的小鼠，以C3H做母本，B6做父本雜交得F1代；將F1代母鼠與B6雄鼠雜交得C3B6<sup>1</sup>，為回交一代；以此輪回雜交十代，得到回交十代的小鼠C3B6<sup>10</sup>；(2)鑒定回交(a)通過Blast兩品系小鼠的線粒體序列，找到4個SNP位點，本實驗通過擴增線粒體片段再對片段進行測序，鑒定回交小鼠的線粒體DNA；(b)從小鼠全基因組中隨機選取40個STR位點，對40個STR位點進行引物設(shè)計，鑒定回交小鼠的基因組DNA。本發(fā)明用于研究小鼠性發(fā)育啟動的影響。文檔編號A01K67/00GK101502248SQ20081020224公開日2009年8月12日申請日期2008年11月5日優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日發(fā)明者周宇荀,周玉梅,戴春花,管清華,肖君華申請人:東華大學(xué)