專利名稱：：新的殺蟲毒素的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及來源于蘇云金芽孢桿菌(Aacj77ws^w2^7f'e/sis)的新的Vip3毒素，其表達引起所述毒素的核酸序列，制備該毒素的方法，及利用該毒素和相應的核酸序列控制昆蟲的方法。
背景技術：
：植物害蟲是世界重要農作物損失的主要因素。僅在美國，每年由非哺乳動物害蟲包括昆蟲的侵染就損失約80億美元。除了農田作物損失外，昆蟲害蟲對于蔬菜和水果種植者，對于觀賞花卉的生產(chǎn)者，和對于家宅園丁也是負擔。目前主要通過化學殺蟲劑的廣泛應用來控制昆蟲害蟲，該化學殺蟲劑可積極抑制昆蟲生長、妨礙昆蟲進食或繁殖的方面，或引起死亡。因此可以達到良好的昆蟲控制，但是這些化學藥品有時也影響其它有益昆蟲?；瘜W殺蟲劑的廣泛應用所引起的另一問題是抗藥性昆蟲品種出現(xiàn)。通過各種抗藥性處理實踐已經(jīng)部分緩解了這種現(xiàn)象，但是對可替代的控制害蟲的藥劑存在日益增加的需要。生物害蟲控制藥劑，如表達殺蟲毒素象5-內毒素的蘇云金芽孢桿菌(^a""^t力"ri/2^z'e/Ls/s)抹系也已經(jīng)施用于農作物，并且具有滿意的結果，這為化學殺蟲劑提供了可替代物或補充物。已經(jīng)分離了編碼這些5-內毒素的一些基因，并已證實它們在異源宿主中的表達提供了用于經(jīng)濟重要昆蟲害蟲控制的另一種工具。特別地，轉基因植物中殺蟲毒素如蘇云金芽孢桿菌(5acj77f/stAwjrj'/^j'e/7s&)5-內毒素的表達提供了免受所針對的昆蟲害蟲侵害的有效保護，并且表達這種毒素的轉基因植物已經(jīng)商品化，使得農民能夠減少化學昆蟲控制藥劑的施用?，F(xiàn)在已經(jīng)鑒定了其它非內毒素基因和它們編碼的蛋白質。美國專利5,877,012，6,107,279，6,137，033和6,291,156，及Estruch等(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-5394)和Yu等(1997，Appl.Environ.Microbiol.63:532-536)描述了稱為Vip3的新一類殺蟲蛋白質，這里并入所有這些文獻為參考文獻。Mp3編碼序列編碼芽孢桿菌(^a^77M)營養(yǎng)生長階段期間產(chǎn)生和分泌的約88kDa蛋白質(營養(yǎng)殺蟲蛋白質，VIP)。Vip3A蛋白質具有抗廣譜鱗翅目害蟲，包括但不限于小地老虎(BCW，yt^ro^'sj>sj7o/z)，草地軲蟲(PAW,5^ocfo/7tejrafrw^pert/a)，煙辨夜蛾(TBW,〃e7j.otAjfs「j.resce/is)，和谷實夜蛾(CEW,^e"corerpazea)的殺蟲活性。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表達Vip3A蛋白質的植物抗半翅目昆蟲害蟲引起的進食損害。因此Vip3A蛋白質顯示了獨特的殺蟲活性譜。其它的專利公開W098/18932，W098/33991，W098/00546，和W099/57282現(xiàn)在也已經(jīng)鑒定了Vip3A類蛋白質的同源物?；瘜W和生物控制方法的連續(xù)應用增加了昆蟲發(fā)展對這種控制方法抗藥性的機會。而且，用目前的方法僅僅可控制幾種特定的昆蟲害蟲。因此，需要開發(fā)出能為農民提供經(jīng)濟利益，并且是環(huán)境可接受的新的和有效的害蟲控制藥劑。特別需要的是靶向較廣譜的經(jīng)濟重要昆蟲害蟲和能有效控制對現(xiàn)存昆蟲控制藥劑有抗藥性或可能產(chǎn)生抗藥性的昆蟲抹系的控制藥劑。而且，也期望獲得其施用對環(huán)境的影響降至最小的藥劑。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供新的基因和毒素而致力于解決新的害蟲控制藥劑的需要，所述新的基因和毒素不同于美國專利5,877,012,6,107,279，和6,137,033,Estruch等(1996)，Yu等(1997)及W098/18932，W098/33991，W099/57282,和W098/00546所公開的基因和毒素。本發(fā)明提供了控制植物害蟲的組合物和方法。特別地，提供了從蘇云金芽孢桿菌(v9ad77ws7^w^7^ie/jws)分離的新rip3核酸序列，基本與其相同的序列，所述序列的表達引起了對經(jīng)濟重要昆蟲害蟲，特別是侵染植物的昆蟲害蟲具有高度特異毒性的殺蟲毒性。本發(fā)明進一步涉及由所述核酸序列表達產(chǎn)生的新的殺蟲毒素，含有該殺蟲毒素的組合物和制劑，它們能抑制昆蟲害蟲存活、生長和繁殖的能力，或能限制與昆蟲有關的農作物損害或損失。本發(fā)明也涉及例如在制備具有更強殺蟲活性的雜合毒素中或在重組基因方法如DNA改組中利用該核酸序列的方法。本發(fā)明進一步涉及制備該毒素的方法，例如在微生物中利用該核酸序列控制昆蟲的方法，或在轉基因植物中利用該核酸序列提供免受昆蟲損害的保護作用的方法，涉及利用殺蟲毒素和包含該殺蟲毒素的組合物和制劑的方法，例如向昆蟲侵染的區(qū)域或預防處理昆蟲易侵染的區(qū)域或植物施用殺蟲毒素或組合物或制劑以提供免受昆蟲害蟲侵害的保護。這里所述新的殺蟲毒素抗昆蟲的活性很高。例如，通過殺蟲毒素可以控制大量經(jīng)濟重要昆蟲害蟲，如鱗翅目歐洲玉米螟fOstrJ'/2ia小菜蛾(/7"e7JaWo"e"3)，秋祐蟲(5^o一terajf27/《J'/e2Y/a)，小地老虎(y4^rotis/psjfo/),谷實夜蛾(He1icoverpazea)，煙對夜蛾(/fe7jf.ot力j's".resce/s)，貪夜蛾(5^oa^/ter3e;rj'^/a),西南玉米螺("j'atraeagra/7i/2'ose77a)，蔗螺("j.atraeasacc力arah's)，地中海玉米螟(5"esa/77jfa/70/7a^rojf'cfe5)，細點突夜域(〃e7icoKerpa/w/7c"《ejra)和棉鈴蟲(/fe7icorejr/aylr巡X^ejra)。所述殺蟲毒素可以單獨使用或與其它昆蟲控制策略聯(lián)合使用，以提供具有最大害蟲控制效力，同時將對環(huán)境的影響降至最小。根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供了包含編碼毒素的核苷酸序列的分離的核酸分子，所述毒素具有抗昆蟲活性，其中所述核苷酸序列(a)與SEQIDN0:1有至少92%序列同一性；或(b)與(a)的核苷酸序列屬同類編碼(isocoding);或(c)編碼與SEQIDNO:3有至少91%序列同一性的氨基酸序列。在該方面一個實施方式中，分離的核酸分子包含與SEQIDNO:1有至少92%序列同一性的核苷酸序列。在該方面的另一個實施方式中，分離的核酸分子包含與同SEQIDNO:1有至少92%序列同一性的核苷酸序列屬同類編碼的核苷酸序列。在進一步實施方式中，分離的核酸分子包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。在該方面另一個實施方式中，分離的核酸分子包含編碼與SEQIDNO:2有至少91%序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在進一步實施方式中，分離的核酸分子包含編碼SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的核苷酸序列。在一個實施方式中，分離的核酸分子包含大腸桿菌(E抹系DH5a中含有的pNOV1325(命名為ATCCPTA-3868)所含的約2.4kbDNA片段。在另一個實施方式中，分離的核酸分子包含大腸桿菌(&coh.)抹系DH5a中含有的pN0V1328(命名為ATCCPTA-3869)中所含的約2.4kbDNA片段。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，分離的核酸分子編碼具抗鱗翅目昆蟲活性的毒素。在進一步實施方式中，鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟fast"/7ia9，小菜蛾(/7"eJ7sx^o"eJ7a)，秋粘蟲(S>o</optera/Jrwg//ei^/a)，小地老虎(/l^ro"'sj7o/2),谷實夜蛾(/feh.core277azea),煙對夜蛾(Zfeh.otAi"s".resce/7s)，貪夜蛾(分of/o/tejraeu.^7/a)，細點突夜蛾(〃e7_z.coFerpa/u"c"《era),棉鈴蟲(Zfeh'coKe27aAr范i《era),煙草天蛾(ife/i/ycaSejrta)，粉斑夜蛾(riric力opi〃sj.a/力，棉紅鈴蟲(尸ec"/o/7/forago5^j77/e7ia)和向曰葵細巻葉蛾(6Vc力j^/isAospes)。本發(fā)明也提供了嵌合基因，其包含與本發(fā)明核酸分子可操作地連接的異源啟動子序列。進一步，本發(fā)明提供了包含這種嵌合基因的重組載體。本發(fā)明也提供了包含這種嵌合基因的病毒。本發(fā)明該方面的病毒可以是動物病毒或植物病毒。進一步，本發(fā)明提供了包含這種嵌合基因的轉基因宿主細胞。本發(fā)明該方面的轉基因宿主細胞可以是動物細胞，細菌細胞，酵母細胞或植物細胞，優(yōu)選植物細胞。更進一步，本發(fā)明提供了包含這種植物細胞的轉基因植物。本發(fā)明該方面的轉基因植物可以是高梁，小麥，向日葵，番茄，甘藍作物，棉花，水稻，大豆，甜菜，甘蔗，煙草，大麥，油籽油菜或玉米，優(yōu)選玉米。進一步，本發(fā)明提供了來自轉基因植物的種子，所述轉基因植物包括高梁，小麥，向日葵，番茄，甘藍作物，棉花，水稻，大豆，甜菜，甘蔗，煙草，大麥，油籽油菜和玉米。在優(yōu)選實施方式中，種子來自于轉基因玉米植物。本發(fā)明也提供了進一步包含編碼第二殺蟲素的第二核酸序列或核酸序列組的轉基因植物。特別優(yōu)選的第二核酸序列是編碼5-內毒素的核酸序列，編碼其它營養(yǎng)殺蟲蛋白質毒素的核酸序列或編碼用于非蛋白質殺蟲素產(chǎn)生途徑的核酸序列。根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供了具有抗昆蟲活性的分離的毒素，其中毒素包含一氨基酸序列，該氨基酸序列(a)與SEQIDNO:2有至少91%序列同一性；或(b)是通過包含與SEQIDN0:1有至少92%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的。在該方面一個實施方式中，分離的毒素包含與SEQIDN0:2有至少91%序列同一性的氨基酸序列。在進一步實施方式中，分離的毒素包含SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列。在該方面另一實施方式中，該分離的毒素是通過包含與SEQIDN0:1有至少92%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的。在又一實施方式中，該分離的毒素是通過包含SEQIDN0:1或SEQIDN0:3中所示核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的。在另一實施方式中，本發(fā)明毒素具有抗鱗翅目昆蟲活性。在進一步實施方式中，毒素具有抗如下昆蟲的活性歐洲玉米螟(^sm7/a〃"Za'7a7^sJ,小菜蛾(/7wteJJaJxZoste7h),秋轱蟲(5^odoptera/7T/^》e2Y/a),小地老虎C4^ro^fsj>sj7o/7)，谷實夜蛾(〃e7/coyer/azea)，煙對夜蛾(〃eh.o^.s".jresce/51)，貪夜蛾(5^ocfo/teraejrj>wa)，細點突夜蛾(Zfe7icoye27apwcn《era)，棉鈴蟲(^eJicoKerpaArfl^era)，煙草天蛾(#aWwca5"ejrta)，粉斑夜蛾(7Wc/o/3iwsya"i)，棉紅鈴蟲(尸ec"/7o/力ora^s5j^/7J'e77a)和向日葵細巻葉蛾(Coc力^t/js力os/)es)。在進一步實施方式中，所述毒素是由保藏為ATCC保藏號PPTA-3868的大腸桿菌(Acoh')抹系或保藏為ATCC保藏號PPTA-3869的大腸桿菌(f.抹系產(chǎn)生的。本發(fā)明也提供了包含控制昆蟲有效量的本發(fā)明內毒素的組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有抗昆蟲毒素活性的方法，包括(a)獲得包含嵌合基因的轉基因宿主細胞，所述嵌合基因本身包含與本發(fā)明核酸分子可操作地連接的異源啟動子序列；和(b)在轉基因細胞中表達該核酸分子，產(chǎn)生了至少一種具有抗昆蟲活性的毒素。在進一步方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)抗昆蟲轉基因植物的方法，包括向轉基因植物中引入本發(fā)明的核酸分子，其中核酸分子可以在轉基因植物中以控制昆蟲的有效量表達。根據(jù)一個實施方式，昆蟲是鱗翅目昆蟲。在進一步實施方式中，鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟fOsrt"'/7j3録jr7ah'J，小菜蛾(尸7"e"a玎7o"e"a)，秋祐蟲(&octo/7tera/>7/^//7er</a),小地老虎(y4^ro"s/psi7o")，谷實夜蛾(〃eJi"coKejTazea),煙椅夜蛾(〃ehot力/s"'7"esce/7s)，貪夜蛾(5^ocfo/te2"aeu>wa)，細點突夜蛾(/fe7/corer/a/w/c"《era)，棉鈴蟲(/feJj.corezpai4r/s/gera)，煙草天織(y)/a/j(/wca5"eita),粉斑夜蛾(;TjTZ'c力c!A/wsia7i),棉紅鈴蟲(尸ecti"op力ora《ossjpj'e77a)和向曰葵細巻葉蛾(CocAyJjfsAos/es)。在進一步方面，本發(fā)明提供了控制昆蟲的方法，包括向昆蟲遞送有效量的本發(fā)明毒素。根據(jù)一個實施方式，昆蟲是鱗翅目昆蟲。在進一步實施方式中，鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟f0sm'/7/a湯ih仏八小茱蛾(尸7f/te仏A^o"e"a)，秋軲蟲(5^oofo/^e_ra/jrwgipeiv/a)，小地老虎(v4^roips/7o/z)，谷實夜蛾(Zfe7i"corerpazea)，煙對夜蛾(〃e7iot力i"s""resce"s),貪夜蛾(5^ocfo/7teraeu>ya)，細點突夜蛾(/fe7icoKejr/a/w/zc^>era)，棉鈴蟲(〃e7icore27a/1r歷&era)，煙草天蛾(#a/7fl^/cs5"ejrta)，粉斑夜蛾(7Wc力o/7wsjf'a/力，棉紅鈴蟲(尸ec"/7o/力ora^ssj7i"e77a)和向曰葵細巻葉蛾(6bc力yh'sAos/)es)。在另一實施方式中，口服遞送給昆蟲毒素。在進一步實施方式中，所述毒素是通過包含表達本發(fā)明毒素的核酸序列的轉基因植物口服遞送的。本發(fā)明也提供了具有抗昆蟲活性的雜合毒素，其中雜合毒素是由包含本發(fā)明核苷酸序列的核酸分子編碼的。在一個實施方式中，本發(fā)明的雜合毒素具有抗鱗翅目昆蟲活性。在進一步實施方式中，鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟f^s^rj'/^aM/Z^7ah.s,,小菜蛾(尸Jute77a玎Jo"eJ7a)，秋軲蟲(5^o如/:era/i^i/e2Y/a)，小地老虎(爿^ro!'psYio/)，谷實夜蛾(〃e2/coKejr/azea)，煙蟑夜蛾(/feh.otA/s,貪夜蛾(5^oJo/taraeu>wa),細點突夜蛾(/fe2jcore27a/w/7cz^>ejra),棉鈴蟲(/feh'coFe27ayln27J>era),煙草天蛾(#a/c^/ca5"ejrta)，粉斑夜蛾(7Wc力o/7f/5^.a/2jf')，棉紅鈴蟲(尸ec"/7o/力ora^ss7piW7a)和向曰葵細巻葉蛾(6bcAyh.sAos/es)。在另一實施方式中，雜合毒素由SEQIDNO:6中所述核苷酸序列編碼。本發(fā)明也提供了包含殺蟲有效量的本發(fā)明雜合毒素的組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有抗昆蟲活性的雜合毒素的方法，包括(a)獲得包含嵌合基因的轉基因宿主細胞，所述嵌合基因在轉基因細胞中表達該核酸分子，這產(chǎn)生了至少一種具有抗昆蟲活性的雜合毒素。在進一步方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)抗昆蟲轉基因植物的方法，包括向轉基因植物中引入本發(fā)明的核酸分子，其中所述核酸分子編碼雜合毒素，并且該雜合毒素可以在轉基因植物中以控制昆蟲的有效量表達。根據(jù)一個實施方式，昆蟲是鱗翅目昆蟲。在另一實施方式中，鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟(OstriniaNubilalis)小菜蛾(Plutellaxylostella),秋祐蟲(Spodpterafrugiperada)，小地老虎(Agrotisipsilon)，谷實夜蛾(Helicoverpazea),煙坊夜蛾(Heliothisvirescens),貪夜蛾(Spodopteraexiguea)，棉紅鈴蟲(尸(Pectinophoragossypiella)，粉斑夜蛾(Trichoplusiani)，向曰葵細巻葉蛾(Cochylishospes)和向曰葵headmoth(Homoesosomaelectellum)。在另一個方面，本發(fā)明提供了控制昆蟲的方法，包括給昆蟲遞送有效量的本發(fā)明雜合毒素。根據(jù)一個實施方式，昆蟲是鱗翅目昆蟲。在優(yōu)選實施方式中，鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟(OstriniaNubilalis)小菜蛾(Plutellaxylostella),秋祐蟲(Spodpterafrugiperada)，小地老虎(Agrotisipsilon)，谷實夜蛾(Helicoverpazea),煙坊夜蛾(Heliothisvirescens),貪夜蛾(Spodopteraexiguea)，棉紅鈴蟲(尸(Pectinophoragossypiella)，粉斑夜蛾(Trichoplusiani)，向曰葵細巻葉蛾(Cochylishospes)和向曰葵headmoth(Homoesosomaelectellum)。在另一實施方式中,雜合毒素經(jīng)口服遞送給昆蟲。在進一步實施方式中，通過轉基因植物向昆蟲口服遞送雜合毒素，所述轉基因植物包含表達本發(fā)明雜合毒素的核酸序列。本發(fā)明也提供了具有抗昆蟲活性的雜合毒素，其中從包含Vip3毒素的羧基末端區(qū)域以及按氨基到羧基的方向與之連接的不同Vip3毒素的氨基末端區(qū)域，其中羧基末端區(qū)域包含與SEQIDNO:2氨基酸579-787有至少75%同一性的氨基酸序列；氨基末端區(qū)域與SEQIDNO:4氨基酸1-578有至少75%同一性。在進一步實施方式中，羧基末端區(qū)域包含SEQIDNO:2氨基酸578-787,氨基末端區(qū)域包含SEQIDNO:5氨基酸1-579。在進一步實施方式中，雜合毒素包含SEQIDNO:7氨基酸1-787。根據(jù)本發(fā)明該方面的雜合毒素是具有抗鱗翅目昆蟲活性的。在進一步實施方式中，鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟fOsm7^aM/A!7a72sJ，小菜蛾(尸7"e7Ja義y7o"e仏)，秋粘蟲(5^ocfoptera/jr〃^z'/)er(/a)，小地老虎(y4^ro"si/si7o/),谷實夜蛾(Helicoverpazea)，煙奸夜蛾(〃e7/otAis".resce/7s)，貪夜蛾(分ocfo/^eraeu>f/a),棉紅鈴蟲(尸ec"/o/力ora《oss7piW7a)，粉斑夜蛾(7i"j'c力c^7fAsj'a7i)，向日葵細巻葉蛾(6bc力jr7isAos/e51)和向曰葵headmoth(〃o邁oeoso邁ae7ecte7Jw邁)。本發(fā)明該方面還包括包含編碼該方面的雜合毒素的核苷酸序列的核酸分子。本發(fā)明也提供了控制昆蟲的方法，其中轉基因植物進一步包含編碼第二殺蟲要素的第二核酸序列或核酸序列組。特別優(yōu)選的第二核酸序列是編碼5-內毒素的核酸序列，編碼另外的營養(yǎng)殺蟲蛋白質毒素的核酸序列或編碼用于非蛋白質性殺蟲要素產(chǎn)生途徑的核酸序列。然而，本發(fā)明另一方面提供了突變本發(fā)明核酸分子的方法，其中所述核酸分子已被切割為期望大小的雙鏈隨機片段庫，該方法包括(a)向雙鏈隨機片段庫中加入一種或多種單鏈或雙鏈寡核苷酸，其中每種寡核苷酸包含與雙鏈模板多核苦酸具有同一性的區(qū)域和具有異源性的區(qū)域；(b)將由此得到的雙鏈隨機片段和寡核苷酸的混合物變性為單鏈片段；(c)在引起單鏈片段在具有同一性的區(qū)域退火的條件下，溫育由此得到的單鏈片段庫和聚合酶，以形成成對的退火片段，同一性區(qū)域足以使配對的一個成員引發(fā)另一成員的復制，由此形成突變的雙鏈多核苷酸；和(d)重復第二和第三步驟至少另兩輪循環(huán)，其中在下一輪循環(huán)第二步驟中得到的混合物包含從前一輪第三步驟得到的突變的雙鏈多核苷酸，并且下一輪循環(huán)形成了進一步突變的雙鏈多核普酸。通過本發(fā)明下面的描述和非限制性實施例的學習，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點對于本領域技術人員將變得顯而易見。序列表中序列的簡要說明SEQIDNO:l是天然^力JB基因的編碼序列。SEQIDNO:2是SEQIDNO:l.編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:3是玉米優(yōu)化的n》5B基因的編碼序列。SEQIDNO:4是天然W/^A基因的編碼序列。SEQIDNO:5是SEQIDNO:4.編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:6是雜合W/^A-B基因的編碼序列。SEQIDNO:7是SEQIDNO:6.編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:8-13是用在本發(fā)明中的引物。保藏根據(jù)國際承認用于專利程序目的的微生物保藏布達佩斯條約，下面材料保藏在美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)，10801UniversityBlvd.,Manassas,VA。一旦授予專利權，將不可撤銷地解除對保藏材料獲得的所有限制。克隆保藏號保藏曰期p麗1325ATCCNo.PTA-38682001年11月16曰p麗1328ATCCNo.PTA-38692001年11月16曰定義本發(fā)明毒素的《活性"意指毒素起具口服活性的昆蟲控制藥劑的作用，有毒性作用，或者能破壞或阻止可能引起或不引起昆蟲死亡的昆蟲進食。當將本發(fā)明毒素遞送給昆蟲時，結果通常是昆蟲死亡，或昆蟲不以產(chǎn)生昆蟲可得到毒素的資源為食。"相關聯(lián)"/呵搡作地連接"指兩個物理或功能相關的核酸序列。例如，如果啟動子或調節(jié)DNA序列和編碼RNA或蛋白質的DNA序列可搡作地連接或定位以至于調節(jié)DNA序列將影響編碼或結構DNA序列的表達水平，那么稱啟動子或調節(jié)DNA序列與編碼RNA或蛋白質的DNA序列相關"。"嵌合基因"是重組核酸序列，其中啟動子或調節(jié)核酸序列可操作地連接編碼mRNA或作為蛋白質表達的核酸序列，或與之相關聯(lián)，這樣調節(jié)核酸序列能調節(jié)相關聯(lián)核酸序列的轉錄或表達。如自然界中所發(fā)現(xiàn)的，嵌合基因的調節(jié)核酸序列通常情況下并不是可操作地與相關聯(lián)的核酸序列連接。"編碼序列"是轉錄為RNA如mRNA,rRNA，tRNA，snRNA，有義RNA或反義RNA的核酸序列。優(yōu)選地，RNA隨后在生物體中翻譯以產(chǎn)生蛋白質。"控制"昆蟲意指通過有毒作用抑制昆蟲害蟲存活、生長、進食和/或繁殖的能力，或意指限制農作物中昆蟲相關的損害或損失。盡管^制"昆蟲優(yōu)選意指殺死昆蟲，但是發(fā)制"昆蟲也可以是指不殺死昆蟲。"遞送"毒素意指毒素與昆蟲接觸，引起有毒作用和昆蟲的控制?？梢杂迷S多公認的方法遞送毒素，例如通過昆蟲攝食口服或通過轉基因植物表達，制成的蛋白質組合物，可噴射的蛋白質組杏物，食^基質，或任何其它本領域公認的毒素遞送系統(tǒng)而與昆蟲接觸。"有效的昆蟲控制量"意指通過有毒作用抑制昆蟲存活，生長，進食和/或繁殖能力或者限制農作物中昆蟲相關的損害或損失的毒素濃度。盡管嗜效昆蟲控制量"優(yōu)選意指殺死昆蟲，但是嗜效的昆蟲控制量"也可以指不殺死昆蟲。這里所用的"表達盒"意指能引導適合宿主細胞中特定核苷酸序列表達的核酸序列，包含與目的核苷酸序列可操作地連接的啟動子，所述目的核苷酸序列可操作地連接終止信號。通常，它也包含該核苷酸序列正確翻譯所需的序列。包含目的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，意指至少其成分之一相對于它的至少一種其它成分是異源的。表達盒也可以是天然的，但以重組形式獲得以用于異源表達。然而，通常表達盒相對于宿主是異源的，即，表達盒的特定核酸序列不天然出現(xiàn)在宿主細胞中，而必須通過轉化事件將其引入宿主細胞或宿主細胞的前體。表達盒中核苷酸序列的表達可以受組成型啟動子或僅當宿主細胞暴露于一些特定外部刺激物時才起始轉錄的誘導型啟動子控制》在多細胞生物體的情況下，如植物，啟動子也可以是對特定組織或器官或發(fā)育階段特異的。"基因"是位于基因組內、除了前述編碼核酸序列外還包含其它主要調節(jié)核酸序列的確定區(qū)域，所述調節(jié)核酸序列負責編碼部分的的表達，即轉錄和翻譯控制?；蛞部梢园渌?，和3，非翻譯序列和終止序列。進一步可以存在的元件是，例如內含子。"目的基因"指任何基因，當轉移其到植物中時，可賦予植物以期望的特性如抗生素抗性，病毒抗性，昆蟲抗性，疾病抗性或對其它害蟲的抗性，除草劑耐受性，改進的營養(yǎng)價值，工業(yè)生產(chǎn)過程中改進的性能或改變的繁殖能力。"目的基因"也可以是轉移到植物中用于植物中有商業(yè)價值的酶或代謝物生產(chǎn)的基因。"異源"核酸序列是與其被引入的宿主細胞不天然相關的核酸序列，包含天然核酸序列以多拷貝非天然存在。"同源"核酸序列是與其被引入的宿主細胞天然相關聯(lián)的核酸序列。詞源重組"是同源核酸分子間核酸片段的相互交換。這里所用的"雜合毒素"是人工制備的殺蟲毒素，其包含一個毒素的氨基酸區(qū)域或片段與來源于不同毒素的氨基酸區(qū)域或片段相連接，例如，將SEQIDNO:2氨基酸579到氨基酸787的Vip犯C-末端區(qū)域和SEQIDNO:5氨基酸1到氨基酸578的Vip3AN-末端區(qū)域相連接，但并不局限于此。"殺蟲的"定義為能控制昆蟲，優(yōu)選殺死它們的毒性生物活性。當核酸序列編碼與參照核酸序列編碼的多肽有相同氨基酸序列的多肽時，該核酸序列與參照核酸序列即屬^!類編碼的"。"分離的"核酸分子或分離的酶是人工地與其天然環(huán)境分離存在，因此不是天然產(chǎn)物的核酸分子或酶。分離的核酸分子或酶可以以純化形式存在，或者可以存在于非天然環(huán)境中，例如重組宿主細胞中。"核酸分子"或紫酸序列"是可以從任何來源分離的單或雙鏈DNA或RNA的線性片段。在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選地，核酸分子是DNA片段。植物"是在任何發(fā)育階段的任何植物，特別是種子植物。貨物細胞"是植物的結構和生理學單位，包含原生質體和細胞壁。植物細胞可以是分離單細胞或培養(yǎng)細胞形式，或作為高等有組織的單位例如植物組織、植物器官或整個植物的一部分。貨物細胞培養(yǎng)物"意指各種發(fā)育階段的植物單位如，例如原生質體，細胞培養(yǎng)物細胞，植物組織中的細胞，花粉，花粉管，胚珠，胚囊，合子和胚的培養(yǎng)物。貨物材料"指葉片，莖，根，花或花的部分，果實，花粉，卵細胞，合子，種子，插條，細胞或組織培養(yǎng)物，或植物的任何其它部分或產(chǎn)物。貨物器官"是植物明顯和可見的結構和分化部分，如根，莖，葉，花蕾或胚。這里所用的祖物組織"意指組織成結構和功能單位的一組植物細胞。包括植物中或培養(yǎng)物中植物的任何組織。該術語包括但不限于整個植物，植物器官，植物種子，組織培養(yǎng)物和組織成結構和/或功能單位的任何植物細胞組。該術語與上述任何特定類型植物組織的聯(lián)合應用或單獨應用或該定義包含其它應用不意^^未排除任何其它類型植物纟且織。"啟動子"是編碼區(qū)域上游的非翻譯DNA序列，其包含RNA聚合酶ll的結合位點，并起始DNA的轉錄。啟動子區(qū)域也可以包含作為基因表達調節(jié)物的其它元件。"原生質體"是沒有細胞壁或僅有部分細胞壁的分離的植物細胞。"調節(jié)元件"指參與控制核苷酸序列表達的序列。調節(jié)元件包含可搡作地連接目的核苷酸序列和終止信號的啟動子。通常它們也包含核苷酸序列正確翻譯所需的序列。"改組"核酸是通過改組方法，如這里所迷的任何改組方法產(chǎn)生的核酸。通過人工并且可選地循環(huán)的方式(物理或實際上)重組兩個或多個核酸(或字符串)可產(chǎn)生改組核酸。一般地，在改組方法中利用一步或多步篩選步驟以鑒定目的核酸；可以在任何重組步驟之前或之后進行該篩選步驟。在一些(但不是所有)改組實施方式中，期望在篩選前進行多輪重組以增加篩選庫的多樣性。任選地，可以循環(huán)重復重組和篩選的全部過程。根據(jù)上下文，改組可以指重組和篩選的全部過程，或者可以僅指全部過程的重組部分?；鞠嗤趦蓚€核酸或蛋白質序列上下文中的短語"基本相同"指當如利用下面序列比較算法之一或目測而比較和比對測定最大對應程度時，具有至少60%，優(yōu)選80%,更優(yōu)選90%,甚至更優(yōu)選95%和最優(yōu)選至少99%核苷酸或氨基酸殘基同一性的兩個或多個序列或亞序列。優(yōu)選地，在至少約50個殘基長度的序列區(qū)域、更優(yōu)選至少約100個殘基的區(qū)域存在基本同一性，最優(yōu)選地在至少約150個殘基中序列是基本相同的。在特別優(yōu)選的實施方式中，在整個編碼序列長度中序列是基本相同的。而且，基本相同的核酸或蛋白質序列履行基本相同的功能。對于序列比較，通常，一個序列作為參照序列而與檢測序列相比較。當利用序列比較算法時，輸入檢測和參照序列進入計算機中，如果必要的話，指定亞序列的坐標和序列算法程序的參數(shù)。然后，根據(jù)選定的程序參數(shù)，序列比較算法將計算出檢測序列相對于參照序列的百分序列同一性。例如，通過Smith&Waterman,脅.粉丄2:482(1981)的局部同源性算法，通過Needleman&Wunsch,5io丄48:443(1970)的同源性比對算法，通過Pearson&Up,,淑J.JcaJ.5*".〃5"y485:2444(1988)的相似性檢索方法，通過這些算法的計算機化實施(WisconsinGenetics軟件包中GAP,BESTFIT:FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGro叩，575ScienceDr.,Madison,WI)或通過目測(通常參見，Ausubel等，下文)可以進行比較序列的最佳比對。適于測定百分序列同一性和序列相似性的一個算法例子是BLAST算法，在Altschul等，/215:403-410(1990)中描述了該算法。通過國家生物技術信息中心(http:〃ww.ncbinlm.nih.gov/)可公開得到進行BLAST分析的軟件。該算法包括通過鑒定出查尋序列中長度為W的短字而首先鑒定出高得分序列對(HSP)，所述短字在與數(shù)據(jù)庫中相同長度的字比對的符合或滿足一些正值域值分T。T稱為相鄰字記分閾值(Altschul等，1990)。這些最初的鄰近字命中作為開始查尋的線索去發(fā)現(xiàn)包含它們的更長的HSP。然后，這些字命中將沿每個序列的兩個方向盡可能遠的延伸，直到積累比對分值不再增加。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(成對匹配殘基的獎勵分值；總是大于零)和N(錯配殘基的罰分值；總是小于零)計算積累分值。對于氨基酸序列，用記分矩陣計算積累分值。當積累比對分值從所獲得的最大值降低X時，終止向各方向的字擊中延伸，由于一個或更多負分值殘基比對積累，或兩個序列的任一個到達終點時，積累分值達到或低于零。BLAST算法的參數(shù)W，T和X決定了比對的敏感性和速度。BLASTN程序內部設定值(對于核苷酸序列)為字長值(W)ll,期望值(E)IO,截斷值100，M=5，N=-4，并比較兩個鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序內部設定值為字長值(W)3,期望值(E)10和BL0S廳2記分矩陣(參見，Henikoff&Henikoff,尸潔.組丄y4cad5T/.飼89:10915(1989))。除了計算百分序列同一性外，BLAST算法也進行兩種序列間相似性的統(tǒng)計學分橋參見，例如1(&1:1111&Altschul,尸roc.〃ai/丄^cad5b,〃W90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一個相似性測定是最小和概率(P(N))，其提供了兩個核苷酸或氨基酸序列間偶然出現(xiàn)匹配的概率指標。例如，如果檢測核酸序列與參照核酸序列比較時最小和概率少于約0.1,更優(yōu)選少于約0.01,最優(yōu)選少于約0.001，那么認為檢測核酸序列與參照序列相似。兩種核酸序列基本相同的另一個指標是兩種分子在嚴格條件下互相雜交。短語,異性雜交"指當該序列存在于復雜混合物(例如，總細胞的)DNA或RNA分子中時，在嚴格條件下，分子僅與特定核苷酸序列結合，形成雙螺旋或雜交。"基本結合"指探針核酸和耙核酸間的互補雜交，并且包含較少的錯配，通過降低雜交介質的嚴格性可以耐受這種錯配，以實現(xiàn)乾核酸序列的期望檢測。在核酸雜交試驗如Southern和Northern雜交上下文中"嚴格雜交條件"和"嚴格雜交漂洗條件"是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。較長的序列在較高溫度下特異性雜交。在Tijssen(1993)ZaAorator/7bc力/7J》wesj7Woc力ez!7jfs^ry朋^/Uecw7ar^Zo7o^x-/^"Wza"o/『2't力yVwc7eic/4"'J尸ro力es，第2章第I部分〃Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays'Elsevier,NewYork中可以找到有關核酸雜交的詳盡的指南。一般地，嚴格性強的雜交和漂洗條件選定為比特定序列在確定的離子濃度和pH下的熱熔點溫度(Tm)低約5x:。通常地，在"嚴格條件"下，探針將與其靶亞序列雜交，而不與其它序列雜交。Tm是(在確定的離子濃度和pH條件下)50%靶序列與完全匹配的探針發(fā)生雜交時的溫度。對于特定的探針，選擇等于Tm的非常嚴格的條件。對于Southern或Northern印跡中濾膜上長度為100個以上互補殘基的互補核酸的雜交，嚴格雜交條件的一個例子是在42C，具有l(wèi)mg肝素的50%甲酰胺，過夜進行該雜交。高嚴格性的漂洗條件的例子是72X:,0.15MNaCl約15分鐘。嚴格漂洗條件的例子是在65"C，0.2xSSC漂洗15分鐘(參見，Sambrook，下文，SSC緩沖液的描述)。通常，在高嚴格性洗滌之前進行低嚴格性的漂洗，以除去背景探針信號。對于例如多于100個核苷酸的雙螺旋而言，中度嚴格性漂洗的例子是45^C,lxSSC漂洗15分鐘。對于例如多于100個核普酸的雙螺旋而言，低嚴格性漂洗的例子是40"C，4-6xSSC漂洗15分鐘。對于短探針(例如，約10到50個核苷酸)，嚴格條件通常包括少于約l.OMNa離子的鹽濃度，通常在pH7.0到8.3,Na離子濃度(或其它鹽)約是O.01到l.OM，通常溫度至少是約30"C。通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺也可以獲得嚴格條件。一般地，在特定雜交測定中信噪比就無關探針所觀察到的值高2倍(或更高)表明檢測到了特異雜交。在嚴格條件下不互相雜交的核脧，如果它們編碼的蛋白質是基本相同的，那么它們仍是基本相同的，例如，當用遺傳密碼所允許的最大密碼子筒并性得到核酸拷貝時，就會出現(xiàn)這種情況。下面是雜交/漂洗條件設置的例子，所述條件可以用于克隆與本發(fā)明參照核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列優(yōu)選參照核苷酸序列與參照核苷酸序列在50t:,70/。十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5MNaP04,lmMEDTA中雜交，在50X:，2XSSC，0.1%SDS中漂洗，更優(yōu)選在50"C，7%十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5MNaP04，lmMEDTA中雜交，在50t:，1XSSC，0.196SDS中漂洗，更優(yōu)選在501C，7%十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5MNaP04，lmMEDTA中雜交，在50t:,0.5XSSC,0.196SDS中漂洗，優(yōu)選地在50t:，7%十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5MNaP04,lmMEDTA中雜交，在50"C,0.1XSSC，0.1%SDS中漂洗，更優(yōu)選地在50",7%十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5MNaP04,lmMEDTA中雜交，在65"C,0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗。兩個核酸序列或蛋白質基本相同的另一個指標是第一核酸編碼的蛋白質與第二核酸編碼的蛋白質可發(fā)生免疫交叉反應或特異結合。因此，在例如其中兩個蛋白質僅僅由于保守性置換而不同時，它們通常是基本相同的。"合成的"指包含天然序列中不存在的結構特征的核苷酸序列。例如，G+C含量和正常密碼子分布更接近于雙子葉和/或單子葉植物基因的人工序列是合成的。"轉化"是向宿主細胞或生物體中引入異源核酸的過程，特別地，轉化"意指DNA分子穩(wěn)定整合進入目的生物體基因組中。"轉化的/轉基因的/重組的"指已經(jīng)引入異源核酸分子的宿主生物體，如細菌或植物。核酸分子可以穩(wěn)定地整合進入宿主基因組，或者，核酸分子也可以作為染色體外分子存在。這種染色體外分子可以是自主復制的。轉化的細胞，組織，或植浙理解為不僅包含轉化過程的最終產(chǎn)物，也包含其轉基因子代。啡轉化的"，啡轉基因的"，或3g重組的"宿主指不含有異源核酸分子的野生型生物體，例如細菌或植物。，ip類蛋白質"包括Vip3A(a),Vip3A(b)，Vip3A(c),Vip3B,Vip3C(a)，Vip3C(b),Vip3Z和它們的同源物，但并不限于此。這里所用的，源物"意指所迷蛋白質或多肽與Vip3類蛋白質的其它成員具有確定的關系。這種確定的關系包括，但不限于l)在序列水平上與Vip3類蛋白質另一個成員有至少70%,更優(yōu)選至少80%,最優(yōu)選至少90%同一性、同時還保持了殺蟲活性的蛋白質，2)與免疫識別Vip3類蛋白質另一個成員的抗體可發(fā)生交叉反應的蛋白質，3)與Vip3類蛋白質另一個成員的受體可發(fā)生交叉反應，并且保留了誘導程序性細胞死亡能力的蛋白質，和4)在序列水平上與Vip3類蛋白質另一個成員的毒性核心區(qū)域有至少70%，更優(yōu)選至少80%,最優(yōu)選至少90%同一性、同時還保持了殺蟲活性的蛋白質。在WO98/18932，W098/33991,WO98/00546和WO99/57282中已經(jīng)公開了其它Vip3同源物。用下面的標準縮寫的堿基表示核苷酸腺噤呤(A),胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)。同樣地，用下面標準縮寫表示氨基酸丙氨酸(Ala;A)，精氨酸(Arg;R)，天冬酰胺(Asn;N)，天冬氨酸(Asp;D),半胱氨酸(Cys;C),谷氨跣胺(Gln;Q)，谷氨酸(Glu;E)，甘氨酸(Gly;G)，組氨酸(His;H)，異亮氨酸(He;1)，亮氨酸(Leu;L),賴氨酸(Lys;K)，甲硫氨酸(Met;M)，苯丙氨酸(Phe;F)，脯氨酸(Pro;P)，絲氨酸(Ser;S),蘇氨酸(Thr;T),色氨酸(Trp;W)，酪氨酸(Tyr;Y)和纈氨酸(Val;V)。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及其表達產(chǎn)生新的毒素的核酸序列，涉及可控制昆蟲害蟲的所述毒素的制備和應用。核酸序列來源于芽孢桿菌屬(Aacj77"s),—種革蘭氏陽性的形成孢子的微生物。特別地，提供了可作為殺蟲劑的新的Vip3蛋白質。對于本發(fā)明的目的，昆蟲害蟲包括選自鞘翅目，雙翅目，膜翅目，鱗翅目，食毛目，同翅目，半翅目，直翅目，纓翅目，革翅目，等翅目，虱目，蚤目，毛翅目等，特別是鱗翅目的昆蟲。本發(fā)明核酸序列的表達產(chǎn)生了可用于控制例如如下鱗翅目昆蟲的毒素歐洲玉米螟("0^7"/77iaiV〃Za7ah\s，小菜蛾(尸7"e77a^x/o"e/7a),秋祐蟲(5^oJo/tejra/"27/^z》ejr7/a),小地老虎(爿^ro"sipsj7o/)，谷實夜蛾(/feh'core77azea)，煙對夜蛾(〃e7i"力J's">e5"ce/7S)，貪夜蛾(5^odo/^erae"'^/a)，細點突夜蛾(〃e7icoreJ7a/7W/7cf_z>e2"a),棉鈴蟲(/feh'co7ejr/aAr邁J'《era)，煙草天蛾(ife/7f/uca5"eita)，粉斑夜蛾(7i^'c力o/7〃sia/7力，棉紅鈴蟲(尸ec""o/7力ora《05^7pie77a)和向曰婆細巻葉域(C0c力7Jis力os/e;)。在一個實施方式中，本發(fā)明包含分離的核酸分子，所述核酸分子包含與SEQIDNO:1序列有至少92%序列同一性的核苷酸序列，該分離的核酸分子的表達產(chǎn)生了可控制昆蟲的活性。當在異源宿主中表達SEQIDNO:l核酸分子時，其產(chǎn)生了抗如下昆蟲的控制活性歐洲玉米螟^W/7J.a録iah-s入小菜蛾(Z^/"e77a玎7o"e"a)，秋粘蟲(5^ocfo/te_ra/77/^7》e7Y/a),小地老虎(々jro"s,谷實夜蛾(〃eJ/core277a,煙對夜蛾(〃e7j'ot力is".resce/7S)，貪夜蛾(^/ocfopferaeu'^7/a),細，$、突夜蛾(Zfe7icoyerpa/7"/7cti^era)，棉鈴蟲(/fe7icoKejr/ay4r邁i《era)，煙草天蛾(#a/7C^/caSejrta)，粉斑夜蛾c力o/^wsia/7i)，棉紅鈴蟲(尸ectj'/JopAoragossTPJeJJa)和向日葵細巻葉蛾(6bc力77/s力os/es)的控制昆蟲的活性，表明SEQIDNO:1所示的核苷酸序列足夠產(chǎn)生這種控制昆蟲的活性。在進一步實施方式中，該分離的核酸分子包含與SEQIDNO:1有至少93%序列同一性的核苷酸序列。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子包含與SEQIDNO:1有至少94%序列同一性的核苷酸序列。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子包含與SEQIDNO:1有至少95%序列同一性的核苷酸序列。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子包含與SEQIDNO:1有至少96%序列同一性的核苷酸序列。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子包含與SEQIDNO:1有至少97%序列同一性的核香酸序列。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子包含與SEQIDNO:1有至少98%序列同一性的核苷酸序列。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子包含與SEQIDNO:1有至少99%序列同一性的核苷酸序列。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子包含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。在另一個實施方式中，本發(fā)明包括包含于pN0V1325中的核酸分子，該核酸分子的表達產(chǎn)生了殺蟲毒素，該pN0V1325保藏在命名為ATCC保藏號PTA-3868的大腸桿菌(&coh.)抹系DH5ot中。在一個實施方式中，本發(fā)明包括包含一種核苷酸序列的分離的核酸分子，該核苷酸序列與同SEQIDNO:1有至少92%序列同一性的核苷酸序列屬同類編碼的，該分離的核酸分子的表達產(chǎn)生了控制昆蟲的活性。當在異源宿主中表達SEQIDNO:3核酸分子時，其產(chǎn)生了抗如下昆蟲的控制活性歐洲玉米螟f0^2^/7iaA^W7a7j's入小菜蛾(/7tfte77axj^oste7Ja)，秋祐蟲(5^octo/tera/Jr〃《j》e2Y/a)，小i也老虎(y4^ro"si/s27o/)，谷實夜蛾(〃e7icorar/7azea),煙奸夜械(/feh.ot力is"'resce/7s)，貪夜蛾(5]pof/optejra,細點突夜械(Zfe7icore27a/w/c"《era)和棉鈴蟲(〃e7icore27ay4jr邁&era),表明SEQIDNO:3所示的核香酸序列足夠產(chǎn)生這種控制昆蟲的活性。在進一步實施方式中，本發(fā)明包括包含于pN0V1328中的核酸分子，該核酸分子的表達產(chǎn)生了殺蟲毒素，該pN0V1328保藏在命名為ATCC保藏號PTA-3869的大腸桿菌(A.co7/)抹系DH5oc中。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子編碼包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列有至少91%序列同一性的氨基酸序列的毒素。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子編碼包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列有至少92%序列同一性的氨基酸序列的毒素在另一個實施方式中，該分離的核酸分子編碼包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列有至少93%序列同一性的氨基酸序列的毒素。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子編碼包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列有至少94%序列同一性的氨基酸序列的毒素。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子編碼包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列有至少95%序列同一性的氨基酸序列的毒素。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子編碼包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列有至少96%序列同一性的氨基酸序列的毒素。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子編碼包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列有至少97%序列同一性的氨基酸序列的毒素。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子編碼包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列有至少98%序列同一性的氨基酸序列的毒素。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子編碼包含與SEQIDNO:2所示氨基酸序列有至少99%序列同一性的氨基酸序列的毒素。在另一個實施方式中，該分離的核酸分子編碼包含SEQIDNO:2所示氨基酸序列的毒素。本發(fā)明也包括包含本發(fā)明核酸序列的重組載體。在這種載體中，優(yōu)選地，該核酸序列包含在表達盒中，該表達盒包含用于在能表達所述核苷酸序列的宿主細胞中表達該核苷酸序列的調節(jié)元件。這種調節(jié)元件通常包含啟動子和終止信號，優(yōu)選地，也包含使得本發(fā)明核酸序列編碼的多肽能夠有效翻譯的元件。包含所述核酸序列的載體通常具有在特定宿主細胞中復制的能力(優(yōu)選地，其作為染色體外分子)，因此可利用它在宿主細胞中擴增本發(fā)明的核酸分子。在一個實施方式中，用于這種載體的宿主細胞是微生物，如細菌，特別是大腸桿菌(&co7j')或芽孢桿菌(5acj77ws)。在另一個實施方式中，用于這種重組載體的宿主細胞是內寄生菌或體表寄生菌。用于這種載體的優(yōu)選宿主細胞是真核生物細胞，如酵母細胞，植物細胞或昆蟲細胞。植物細胞如玉米細胞是最優(yōu)選的宿主細胞。在另一個優(yōu)選實施方式中，這種載體是病毒載體，并且可用于在特定宿主細胞例如昆蟲細胞或植物細胞中復制所述核苷酸序列。重組載體也用于將本發(fā)明核苷酸序列轉化到宿主細胞內，從而該核苷酸序列穩(wěn)定整合進入這種宿主細胞的DNA中。在一個實施方式中，這種宿主細胞是原核生物細胞。在優(yōu)選實施方式中，這種宿主細胞是真核細胞，如酵母細胞，昆蟲細胞或植物細胞。在最優(yōu)選的實施方式中，宿主細胞是植物細胞，如玉米細胞。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)具有抗昆蟲活性的毒素的方法，包括(a)獲得本發(fā)明的轉基因宿主細胞，和(b)在轉基因宿主細胞中表達本發(fā)明的核酸分子，從而產(chǎn)生至少一種具有抗昆蟲活性的毒素。本發(fā)明進一步提供了生產(chǎn)抗昆蟲的轉基因植物的方法，包括向轉基因植物中引入本發(fā)明的核酸分子，其中轉基因植物中該核酸分子能夠以控制昆蟲的有效量表達。在另一個實施方式中，昆蟲是鱗翅目昆蟲。在另一個實施方式中，該鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟f0^7^/7ia〃〃Z)i7ahsJ,小菜蛾(尸7wte77ajj^/oste77a)，秋軲蟲(5^oo^/^era/zv/^z/er^a)，小地老虎(J^ro"s2>siio/z)，谷實夜蛾(〃ei/coKei7azea),煙坊夜蛾(Zfe7j'"Ais">esce/7s)，貪夜蛾(5^ocfo/7tejraejrjf>〃a),細點突夜蛾(〃e7j'corei7a/)〃/7c^'《era)，棉鈴蟲(〃eh'core27a/ln27J>era),煙草天蛾(5"e;rta),粉斑夜蛾(7Wc力o/7〃Sj'a/力，棉紅鈴蟲(尸ec"/7o/7力Ojra《ossjyie77a)和向曰婆細巻葉域(6"ocAj^is力os/es)。在另一方面，本發(fā)明提供了具有抗昆蟲活性的分離的毒素，其中所述毒素包含(a)與SEQIDNO:2有至少91%序列同一性的氨基酸序列；或(b)由包含與SEQIDNO:1有至少92%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了具有抗昆蟲活性的分離的毒素，其中所述毒素包含與SEQIDNO:2有至少91%序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方式中，該毒素包含與SEQIDNO:2有至少92%序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方式中，該毒素包含與SEQIDNO:2有至少93%序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方式中，該毒素包含與SEQIDNO:2有至少94%序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方式中，該毒素包含與SEQIDNO:2有至少95%序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方式中，該毒素包含與SEQIDNO:2有至少96%序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方式中，該毒素包含與SEQIDNO:2有至少97%序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方式中，該毒素包含與SEQIDNO:2有至少98°/。序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方式中，該毒素包含與SEQIDNO:2有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方式中，毒素包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了具有抗昆蟲活性的毒素，其中所述毒素是通過包含與SEQIDNO:1有至少92%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子的表達產(chǎn)生的。在另一個實施方式中，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1有至少93%序列同一性。在另一個實施方式中，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1有至少94%序列同一性。在另一個實施方式中，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1有至少95%序列同一性。在另一個實施方式中，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1有至少96%序列同一性。在另一個實施方式中，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1有至少97%序列同一性。在另一個實施方式中，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1有至少98%序列同一性。在另一個實施方式中，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1有至少99%序列同一性。在另一個實施方式中，所述毒素是通過包含SEQIDNO:1核香酸1-2364或SEQIDNO:3核苷酸1-2364的核苷酸序列的表達產(chǎn)生的。在一個實施方式中，本發(fā)明的毒素是通過對包含作為ATCC保藏號PTA-3868保藏的pNOV1325中所含的約2.4kbDNA片段的核苷酸序列進行表達而產(chǎn)生的。在另一個實施方式中，本發(fā)明的毒素是通過對包含作為ATCC保藏號PTA-3869保藏的pNOV1328中所含的約2.4kbDNA片段的核苷酸序列進行表達而產(chǎn)生的。在另一個實施方式中，本發(fā)明毒素是由命名為ATCC保藏號PTA-3868的大腸桿菌(Aco7/)抹系產(chǎn)生的。在另一個實施方式中，本發(fā)明毒素是由命名為ATCC保藏號PTA-3869的大腸桿菌(Aco7i)抹系產(chǎn)生的。當在生物測定中試驗本發(fā)明毒素抗昆蟲害蟲時，本發(fā)明毒素有控制昆蟲的活性。在一個實施方式中，本發(fā)明毒素具有抗鱗翅目昆蟲的活性。在進一步實施方式中，鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟(^s^r^^a湯/7ah.sJ,小菜蛾(尸7wte仏玎7c^e7/a)，秋祐蟲(5^oofo/7terafrugiperda)，小地老虎Agrotisipsilon),谷實夜蛾(Helicoverpazea)，煙蚜夜蛾(Heliothisvirescens),貪夜蛾(Spodopteraexigua)，細點突夜蛾Helicoverpapunctigera)，棉鈴蟲(HelicoverpaArmigera),煙草天蛾(ManducaSexta),粉斑夜蛾(Trichoplusiani)，棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiclla)和向日葵細巻葉蛾(Cochylishospes)。在實施例5和實施例8中進一步示例闡述了本發(fā)明殺蟲毒素的昆蟲控制特性。本發(fā)明也包括具有抗昆蟲活性的雜合毒素，其中所述雜合毒素是由包含如下核普酸序列的核酸分子編碼的，該核苷酸序列(a)在501C，7%十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5MNaP04，lmMEDTA中能夠與SEQIDNO:1核苷酸1734-2364雜交(在65"C，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗)；或(b)與(a)的核苷酸序列屬同類編碼的；或(c)包含按序與(a)或(b)核苷酸序列的連續(xù)20個堿基對核苷酸部分相同的連續(xù)20個堿基對核苷酸部分，其中所迷核酸分子的表達產(chǎn)生了控制昆蟲的活性。這里具體示例的是SEQIDNO:6所示核苷酸序列編碼的雜合毒素。當在異源宿主中表達SEQIDNO:6核酸分子時，其產(chǎn)生了抗如下昆蟲的控制活性歐洲玉米螟(OstriniaNubilalis),小茱蛾(Plutellaxylostella)，秋粘蟲(Spodopterafrugiperda)，小地老虎(Agrotisipsilon)，谷實夜蛾(Helicoverpazea),煙蚜夜蛾(Heliothisvirescens),貪夜蛾(Spodopteraexigua)，粉斑夜蛾(Trichoplusiani),向日葵細巻葉蛾(Cochylishospes)和向日葵headmoth(Homoeosomaelectellum)。本發(fā)明也包括具有抗昆蟲活性的雜合毒素，其包含Vip3毒素羧基末端區(qū)域和按從氨基到羧基的方向與之連接的不同Vip3毒素的氨基末端區(qū)域，其中所述羧基末端區(qū)域包含與SEQIDNO:2氨基酸579-787有至少75%同一性的氨基酸序列；所述氨基末端區(qū)域與SEQIDNO:5氨基酸1-578有至少75%的同一性。在進一步實施方式中，該羧基末端區(qū)域包含SEQIDNO:2氨基酸579-787，該氨基末端區(qū)域包含SEQIDNO:5氨基酸1-578。在另一個實施方式中，雜合毒素包含SEQIDNO:6氨基酸1-787。異源微生物宿主中核苷酸序列的表達作為生物控制昆蟲的試劑，殺蟲毒素可通過在能表達核苷酸序列的異源宿主細胞中表達該核苷酸序列而產(chǎn)生。在第一個實施方式中，產(chǎn)生了包含本發(fā)明核苷酸序列修飾的蘇云金芽孢桿菌7y^n'/7^'e/sh)細胞。這種修飾包含現(xiàn)存調節(jié)元件的突變或缺失，因此引起了核苷酸序列改變的表達，或者引入了控制核苷酸序列表達的新調節(jié)元件。在另一個實施方式中，通過向染色體內插入或通過含有該核苷酸序列的染色體外復制分子的引入，向蘇云金芽孢桿菌(5acJ'77iAsT^〃jri/7^r-e/7s^s)細胞中加入一個或多個所述核脊酸序列的額外拷貝。在另一個實施方式中，將至少一種本發(fā)明核苷酸序列插入到適合的表達盒中，該表達盒包含啟動子和終止信號。核苷酸序列的表達是組成型的，或可利用對各種類型刺激物反應以起始轉錄的誘導型啟動子。在優(yōu)選實施方式中，表達毒素的細胞是微生物，如病毒，細菌或真菌。在優(yōu)選實施方式中，病毒如桿狀病毒基因組中含有本發(fā)明核苷酸序列，感染適合病毒復制和所述核苷酸序列表達的真核生物細胞后可表達大量的相應殺蟲毒素。由此產(chǎn)生的殺蟲毒素用作殺蟲劑?？商娲兀没蚬こ谈脑斐砂摵塑账嵝蛄械臈U狀病毒體內感染昆蟲，通過殺蟲毒素的表達或通過病毒感染和殺蟲毒素的表達的聯(lián)合來殺死昆蟲。細菌細胞也是用于本發(fā)朋核苷酸序列表達的宿主。在優(yōu)選實施方式中，利用能在植物組織內生活和繁殖的非致病共生細菌(通常所說的內寄生菌)或能在葉際或根際集落化的非致病共生細菌(通常所說的體表寄生菌)。這種細菌包括農桿菌屬(J^7Y^acteri咖)，產(chǎn)堿桿菌屬ClZca7/ge/7es)，固氮根瘤菌屬(^zo5^n'"咖)，固氮菌屬(y4zo^actejr),芽孢桿菌屬(Aacm〃s)，棍狀桿菌屬(67ayj7acter)，腸桿菌屬(^nteroAacter),歐文氏菌屬(￡r7'/7_fa)，黃桿菌屬(尸7a^6a"er),克氏桿菌屬(iT7e6w'"7a),假單胞菌屬(尸sew^/o膨/7as)，根瘤菌屬(欣izo》i"咖),沙雷氏菌屬(5"errat_z'a),鏈霉菌屬(5"tre/to巡yces)和黃單胞菌屬(Ja/t力o頂o/a5:)的細菌。共生真菌，如木霉菌屬(7^'c力oJejr頂a)和膠霉屬(67j'ocho^w邁)也可能用作本發(fā)明核苷酸序列表達的宿主以用于同一目的。這些基因操作技術對于可供利用的不同宿主是特定的，而且是本領域已知的。例如，表達載體pKK223-3和pKK223-2可以用于在大腸桿菌(coh)中表達tac或trc啟動子后轉錄或翻譯融合形式的異源基因。對于編碼多ORFs(開放讀框)操縱子的表達，最簡單的方法是以轉錄融合方式在載體，如pKK223-3中插入該操縱子，使得能夠利用異源基因的同源核糖體結合位點。在革蘭氏陽性物種如芽孢桿菌(5ac_z'_/7ws)中過量表達的技術也是本領域已知的，其也可以在本發(fā)明上下文中使用(Quax等,In:IndustrialMicroorganisms:BasicandAppliedMolecularGenetics,Baltz等編輯,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington(1993))?？商娲倪^量表達系統(tǒng)依賴于例如酵母栽體，包括畢赤酵母屬(Pic力j'a)，酵母屬(5"acc力aro頂yces)和克魯維酵母菌屬(A7"77e2Y邁yces)(Sreekrishna，In:Industrialmicroorganisms:basicandappliedmoleculargenetics,Baltz，Hegeman和Skatrud編輯，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington(1993);Dequin&Barre，BiotechnologyL2:173-177(1994);vandenBerg等，Biotechnology8:135-139(1990))。植物轉化在特別優(yōu)選實施方式中，在高等生物體例如植物中表達至少一種本發(fā)明的殺蟲毒素。在這種情況下，表達有效量的毒素的轉基因植物保護其本身免受昆蟲害蟲的侵害。當昆蟲開始以這種轉基因植物為食時，它也攝食了表達的毒素。這將阻止昆蟲進一步咬食植物組織，或者甚至傷害或殺死昆蟲?？蓪⒈景l(fā)明核苷酸序列插入到表達盒中，然后優(yōu)選地，表達盒穩(wěn)定整合在所述植物基因組中。在另一個優(yōu)選實施方式中，所述核苷酸序列包含在非致病性的自我復制病毒中。按照本發(fā)明轉化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，包括但不限于玉米，小麥，大麥，黑麥，甘薯，豆，豌豆，菊苣，萵苣，甘藍，花椰菜，花莖甘藍，蕪菁，蘿卜，菱菜，聲畀，洋蔥，大蒜，胡椒，芽菜，,瓜，南瓜，大麻，夏南瓜，蘋果，梨，溫桴，瓜，李子，櫻挑，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，菠蘿，鱷梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向曰葵，油菜籽，三葉草，煙草，胡蘿卜，棉花，苜蓿，水稻，馬鈴薯，茄子，黃瓜，擬南芥和木本植物如松柏科和落葉樹木。一旦已將期望的核苷酸序列轉化進入特定植物物種中，就可以在該物種中繁殖它或用常規(guī)育種技術將它轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。優(yōu)選地，在轉基因植物中表達本發(fā)明的核苷酸序列，因此在轉基因植物中引起了相應毒素的生物合成。以這種方式，可產(chǎn)生具有增強抗昆蟲抗性的轉基因植物。為了在轉基因植物中表達本發(fā)明核普酸序列，本發(fā)明核苷酸序列可能需要修飾和優(yōu)化。盡管在許多情況下來源于微生物的基因不用修飾就可以在植物中高水平的表達，但是具有在植物中不偏愛的密碼子的微生物核苷酸序列可能引起轉基因植物中低水平的表達。所有生物體都有特定的密碼子使用偏愛性，這是本領域已知的，可以在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性。而且，從有至少約35%，優(yōu)選多于約45%,更優(yōu)選多于50%,最優(yōu)選多于約60"/。GC含量的編碼序列可以最好地實現(xiàn)植物中高水平的表達。由于存在可能使信息去穩(wěn)定的ATTTA基序和可以引起不合適的聚腺苷酸化的AATAAA基序，有低GC含量的微生物核苦酸序列在植物中可能低水平地表達。盡管可以在單子葉植物和雙子葉植物物種中充分地表達優(yōu)選的基因序列，可以修飾序列以適應單子葉植物或雙子葉植物的特異密碼子偏好和GC含量偏好，因為這些偏好已被證明是不同的(Murray等，Nucl.AcidsRes.17:477-498(1989))。此外，可篩選核苷酸序列以尋找引起信息截短的非常規(guī)剪接位點。利用專利申請公開EP0385962,EP03594721和WO93/07278中所述的方法，用本領域熟知的定點誘變技術，PCR和合成基因構建可以進行上述這些核苷酸序列中需要進行的所有改變。在本發(fā)明一個實施方式中，根據(jù)這里并入作為參考文獻的美國專利5,625，136中公開的方法可制備r/p3B基因。在該方法中，利用了玉米優(yōu)選的密碼子，即最常常編碼玉米中氨基酸的單密碼子。特定氨基酸的玉米優(yōu)選密碼子可以來源于，例如玉米的已知基因序列。在Murray等，NucleicAcidsResearch17:477-498(1989)中教導了玉米植物28種基因的玉米密碼子使用，這里并入這篇文獻的公開內容為參考文獻。制備的具有玉米最優(yōu)密碼子的合成序列如SEQIDNO:2中所示。以這種方式可以優(yōu)化核苷酸序列以便在任何植物中表達。公認基因序列的所有或任何部分都可以優(yōu)化或合成。即，也可以利用合成或部分優(yōu)化的序列。為了翻譯的有效起始，可能需要修飾鄰近起始甲硫氨酸的序列。例如，通過包含已知在植物中有效的序列可以修飾它們。Joshi提出了植物適合的共有序列(NAR15:6643-6653(1987))，Clonetech提出了進一步的翻譯起始子共有序列(1993/1994目錄，210頁)。這些共有序列適合與本發(fā)明核普酸序列一起使用。向包含所述核苷酸序列摻入該序列，直到和包含ATG(同時保持第二個氨基酸沒有被修飾)，或者直到和包含ATG后的GTC(有可能修飾轉基因的第二個氨基酸)。的^力毒素基周可操作地與在植物中表達的各種啟動子，包括組成型，誘導型，時序調節(jié)，發(fā)育調節(jié)，化學調節(jié)，組織優(yōu)選和組織特異性啟動子相隔合，以制備重組DNA分子，即嵌合基因。啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種。因此，優(yōu)選在葉片，主莖或莖桿，穗，花序(例如，穗狀花序，圓錐花序，穗軸等)，根，和/或幼苗中表達本發(fā)明核苷酸序列。然而，在許多情況下，需要提供抗多于一種類型的昆蟲害蟲的保護，因此期望在多組織中表達。盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達。然而，沒有限制所選啟動子的起源，只要啟動子能在期望細胞中驅動所述核苷酸序列的表達就足夠了。優(yōu)選的組成型啟動子包括CaMV35S和19S啟動子(Fraley等，1994年10月4日公布的美國專利號5,352,605)。另外優(yōu)選的啟動子來源于在大多數(shù)細胞類型中表達的幾種肌動蛋白基因的任何一種?？梢匀菀椎匦揎桵cElroy等(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))所述的啟動子表達盒以用于新毒素基因的表達，該基因表達盒特別適合在單子葉植物宿主中使用。另一個優(yōu)選的組成型啟動子來源于泛素，它是已知在許多細胞類型中積累的另一種基因產(chǎn)物。已從幾種物種，例如向日葵(Binet等，1991.PlantScience79:87-94),玉米(Christensen等，1989.PlantMolec.Biol.12:619-632)和擬南芥(Norris等1993.PlantMolec.Biol.21:895-906)克隆了泛素啟動子，可以用于轉基因植物中。已發(fā)展了轉基因單子葉植物系統(tǒng)中的玉米泛素啟動(〃&力，并且在專利公布EP0342926中公開了其序列和用于單子葉植物轉化的載體。泛素啟動子適合用于在轉基因植物，特別是單子葉植物中表達該新毒素基因?？捎糜谠谥参铮貏e是玉米中表達本發(fā)明新毒素基因的組織特異性或組織偏愛啟動子是可在根，木髓(pith)，葉片或花粉中引導表達的啟動子。在WO93/07278中公開了這種啟動子，這里整體并入其為參考文獻。其它可用在本發(fā)明中的組織特異性啟動子包括美國專利6,040,504中公開的棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子；美國專利5,604,121中7>開的水稻蔗糖合成酶啟動子；和W001/73087中公開的夜香樹黃化葉巻曲病毒(cestrumyellowleafcurlingvirus)啟動子，并入所有這些文獻為參考文獻。在美國專利5，614,395中公開了用于指導植物中新毒素基因表達的化學誘導型(cestrumyellowleafcurlingvirus)啟動子，這里整體并入這篇文獻為參考文獻。也可以在化學調節(jié)型啟動子調節(jié)下表達本發(fā)明核苷酸序列。這能夠使得僅僅在用誘導化學試劑處理農作物時才能合成Vip3毒素。在公開的申請EP0332104(申請人Ciba-Geigy)和美國專利5,614，395中詳述了基因表達化學誘導的優(yōu)選技術。化學誘導的優(yōu)選啟動子是煙草PR-la啟動子。優(yōu)選的啟動子種類是創(chuàng)傷誘導型啟動子。已描述了在創(chuàng)傷位點及植物病原體感染位點表達的大量啟動子。理想地，這種啟動子應該僅在感染位點局部有活性，從而殺蟲毒素僅在需要合成殺蟲毒素以殺死入侵昆蟲害蟲的細胞中積累。優(yōu)選的這種啟動子包括Stanford等，Mol.Gen.Genet.215:200-208(1989)，Xu等，PlantMolec.Biol.22:573-588(1993),Loge,n等，PlantCell1:15H58(1989),Rohrmeier&Lehle，PlantMolec.Biol.22:783-792(1993)，F(xiàn)irek等，PlantMolec.Biol.22:129-142(1993)，和Warner等，PlantJ.3:191-201(1993)所述的啟動子。優(yōu)選的組織特異性表達模式包括綠色組織特異性，根特異性，莖特異性和花特異性。適于綠色組織中表達的啟動子包括許多調節(jié)參與光合作用基因的啟動子，這樣的許多啟動子已從單子葉植物和雙子葉植物中克隆出來了。優(yōu)選的啟動子是來源于磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC啟動子(Hudspeth&Grula，PlantMolec.Biol.12:579-589(1989))。根特異性表達的優(yōu)選啟動子是deFramond(FEBS290:103-106(1991);EP0452269toCiba-Geigy)所述的啟動子。優(yōu)選的莖特異性啟動子是美國專利5,625,136(授予Ciba-Geigy)中所述的啟動子，該啟動子驅動玉米trpA基因的表達。其它優(yōu)選實施方式是以創(chuàng)傷誘導方式或病原體感染誘導方式表達所述核普酸序列的轉基因植物。除了適合啟動子的選擇外，植物中殺蟲毒素表達的構建需要連接在異源核苷酸序列下游的適合的轉錄終止子。可得到幾種這樣的終止子，并且它們是本領域已知的(例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9)。任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以用在本發(fā)明上下文中。也可以向本發(fā)明所述表達盒中引入大量其它的序列。這些序列包括已經(jīng)證明可增強表達的序列，如內含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導序列(例如來源于麗，MCMV和AMV)。有可能優(yōu)選將本發(fā)明核苷酸序列的表達牝向到植物中不同細胞定位。在一些情況下，可能期望定位在細胞溶膠中，而在其它情況下，可能優(yōu)選定位在一些亞細胞細胞器中。轉基因所編碼的酶的亞細胞定位可采用本領域熟知的技術。通常，搡作編碼來源于已知靶向細胞器的基因產(chǎn)物的靶肽的DNA，使之融合到核苷酸序列的上游。已知用于葉綠體的許多這種靶序列，并且已證明了它們在異源構建中的功能。本發(fā)明核香酸序列的表達也可靶向到宿主細胞的內質網(wǎng)或液泡中。實現(xiàn)上述這些目的的技術是本領域熟知的。在本說明書以外描述了適于植物轉化的載體。對于農桿菌(Agrobacterium)介導的轉化，雙元載體或帶有至少一個T-DNA邊界序列的栽體是適合的，而對于直接的基因轉移，任何栽體都是適合的，并且優(yōu)選僅含有目的構建體的線性DNA。在直接基因轉移的情況下，可以進行利用單一DNA種類的轉化或共轉化(Schocher等，Biotechnology4:1093-1096(1986))。對于直接基因轉移和農桿菌(Agrobacterium)介導的轉移，通常(但不是必需)采用選擇標記，該選擇標記可以提供對抗生素(卡那霉素，潮霉素，或氨甲喋呤)或除草劑(basta)的抗性。然而，選擇標記的選擇對本發(fā)明不是至關重要的。在另一個優(yōu)選實施方式中，可直接將本發(fā)明核苷酸序列轉化進入質體基因組中。質體轉化的主要優(yōu)點是質體通常不需要實質修飾就能表達細菌基因，并且質體能表達單一啟動子控制下的多個開放讀框。在美國專利5451513，5545817和5545818中，PCT申請?zhí)朩O95/16783中和McBride等，(1994)Proc.Nati.Acad.Sci.USA91,7301-7305中詳盡地描述了質體轉化技術。葉綠體轉化的基本技術包括例如利用biolistics或原生質體轉4匕(例如氯化釣或PEG介導的轉化)將目的基因和位于選擇標記側翼的克隆質體DNA區(qū)域一起引入適合的靶組織中。l到1.5kb側翼區(qū)域，稱為導向序列，可促進與質體基因組的同源重組，因此允許原質體系(plastome)特定區(qū)域的置換和修飾。最初，可利用在提供壯觀霉素和/或鏈霉素抗性的葉綠體16SrRNA和rps12基因的點突變作為轉化的選擇標記(Svab,Z.，Hajdukiewicz，P.，和Maliga，P.(1990)Proc.Nati.Acad.Sci.USA87,8526-8530;Staub，J.M.，和Maliga,P.(1992)PlantCell4，39-45)。這以約每100次靶葉片轟擊約1次的頻率產(chǎn)生穩(wěn)定的同質轉化體。這些標記間存在的克隆位點可用來產(chǎn)生用于導入外源基因的質體把向載體(Staub，J.M.,和Maliga,P.(1993)EMBOJ.12,601-606)。通過用顯性選擇標記，如編碼壯觀霉素去毒酶(detoxifyingenzyme)酶氨基糖苷-3，-腺香酰轉移酶的細菌aadA基因置換隱性rRNA或r-蛋白質抗生素抗性基因可使轉化頻率顯著增加(Svab,Z.和Maliga,P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,913-917)。以前，該標記已成功地用于高頻率轉化C力7a/2^cfo歷o/asr"/7力arfi^j.j.的質體基因組((Goldschmidt-Cler隨t，)M.(1991)Nucl.AcidsRes.19:4083-4089)。其它可用于質體轉化的逸擇標記是本領域已知的，并且包含在本發(fā)明范圍內。通常，轉化后需要約15到20個細胞分裂循環(huán)以達到同質狀態(tài)。通過同源重組將基因插入利用了拷貝數(shù)大大高于核表達基因的優(yōu)勢^使得表達水平可以容易地超過總可溶植物蛋白質的10%。在優(yōu)選實施方式中，將本發(fā)明核苷酸序列插入到質體靶向栽體中，并且轉化進入期望的植物宿主質體基因組中。獲得了對于含有本發(fā)明核苷酸序列的質體基因組而言屬同質的植物，優(yōu)選地，該植物具有高水平地表達該核苷酸序列的能力。控制昆蟲要素的聯(lián)合可以聯(lián)合Bt5-內毒素或其它殺蟲要素來使用本發(fā)明的殺蟲毒素以增加害蟲靶范圍。而且，本發(fā)明殺蟲毒素與Bt5-內毒素或其它不同特性的殺蟲要素的聯(lián)合使用，對于昆蟲抗性的預防和/或處理具有特定的用途。已經(jīng)根據(jù)蘇云金芽孢桿菌(Aac2'77wsWwri/7^'e/w、)的各種殺蟲結晶蛋白質的活性譜和序列相似性對其進行了分類。然后，Hofte和Whiteley,Microbiol.Rev.53:242-255(1989)提出的分類將已知的殺蟲結晶蛋白質分為4大類。通常，通過活性譜定義所述的大類，Cryl蛋白質具有抗鱗翅目活性，Cry2蛋白質具有抗鱗翅目和雙翅目活性，Cry3蛋白質具有抗鞘翅目活性，Cry4蛋白質具有抗雙翅目活性。在每個大類中，根據(jù)序列相似性將5-內毒素組分。Cryl蛋白質通常以130-140kDa前毒素蛋白質產(chǎn)生，蛋白酶解切割該前毒素后產(chǎn)生約60-70kDa的活性毒素。&-內毒素的活性部分存在于全長分子的肌-末端部分。然后，Hofte和Whiteley(上文)將已知的Cryl蛋白質分為6組，lAa，1Ab，lAc，1B，1C和1D。從此，也鑒定了分類為CrylEa,CrylFa，Cry9A,Cry9C和Cry9B及其它類的蛋白質。蘇云金芽孢桿菌(Bacikllusthuringiensis)各5-內毒素的殺蟲活性譜趨向于非常窄，一種5-內毒素僅僅抗幾種昆蟲。特異性是參與產(chǎn)生活性毒素蛋白質的各個步驟的效率和其隨后與昆蟲消化道上皮細胞相互作用的能力的結果。在一個優(yōu)選實施方式中，轉基因植物中本發(fā)明核酸分子的表達伴隨著一種或多種Bt5-內毒素的表達。特別優(yōu)選的Bt5-內毒素是在美國專利5,625,136中公開的Bt5-內毒素，這里并入其為參考文獻。熟知許多蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的5-內毒素蛋白質實際上以前毒素(protoxin)形式表達。這些前毒素在昆蟲腸道堿性環(huán)境中發(fā)生溶解，通過蛋白酶的蛋白酶解轉化為有毒的核心片段(Hofte和Whiteley，Microbiol.Rev.53:242-255(1989))。對于Cryl類的5-內毒素蛋白質，有毒的核心片段定位在前毒素N末端一半中。在本發(fā)明范圍內，在植物轉化載體中可以利用編碼全長前毒素形式或新毒素蛋白質的截短形式的有毒核心片段的基因以提供對宿主植物的殺蟲特性。其它的殺蟲要素包括蛋白酶抑制劑(絲氨酸和半胱氨酸類型)，凝集素，a-淀粉酶，過氧化物酶和膽固醇氧化酶。本發(fā)明中也可利用其它Vip編碼序列，如美國專利5,849,870中所公開的"》lA(a)和ri/2A(a)，這里并入其為參考文獻?？梢酝ㄟ^基因工程改造植物以含有和表達所有必需的基因來實現(xiàn)同一轉基因植物中該多個殺蟲要素的共表達。可替代地，可以基因工程改造植物親本1以表達本發(fā)明基因?？梢曰蚬こ谈脑斓诙ㄖ参锛从H本2以表達補充的控制昆蟲要素。通過雜交親本1和親本2，可獲得表達引入親本1和親本2中的所有基因的子代植物。本發(fā)明也包含所公開核酸分子的變體。通過應用熟知的分子生物學技術，例如，如下所概述的PCR和雜交技術，可以鑒定和/或分離天然存在的變體序列。變體Wp3核苷酸序列包括合成來源的核苦酸序列，如，例如通過利用定點誘變產(chǎn)生的核苷酸序列，或通過整個結構域交換產(chǎn)生的核苷酸序列，但是這些核普酸序列仍然顯示了殺蟲活性。誘變和核普酸序列改變的方法是本領域已知的。參見，例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492;Kunkel等(1987)MethodsinEnzymol.154:367-382;美國專利號4,873,192;Walker和Gaastra編輯(1983)TechniquesinMolecularBiology(MacMillan)PublishingCompany,NewYork)及其中引用的參考文獻。通常，本發(fā)明的核苷酸序列與其相應的參照n》3核苷酸序列有至少80%,優(yōu)選85%,90%，95%,達到98%或更多的序列同一性，并且有殺蟲活性。變體Vip3核苷酸序列也包含來源于誘變和重組方法如DNA改組的序列。用這種方法，可以將本發(fā)明的一種或多種不同的n》3序列(例如Wp3B和w》3A-B，但不限于此)重組在一起，或與其它r/p3或相關序列(例如非kj73A(SEQIDNO:5)，但不限于此)相重組，以產(chǎn)生編碼具有期望特性的Vip3毒素的新la》3核酸分子。用這種方式，可從序列相關的n力3多核苷酸庫產(chǎn)生重組h力3多核苷酸文庫，所述序列相關性h'/3多核苷酸包含有基本序列同一性的序列區(qū)域，并且可以在體外或體內同源重組。用于這種DNA改組的策略是本領域已知的。參見，例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751;Stemmer(1994)Nature370:389-391;Crameri等，(1997)NatureBiotech.15:436-438;Moore等，(1997)J.Mol.Biol.272:336-347;Zhang等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509;Cr畫ri等，(1998)Nature391:288-291;國際專利申請WO99/57128和美國專利號5,605,793,5,837,458和6，335，179?？梢詫⑦@里公開的誘變方法和高處理量的篩選方法聯(lián)合應用，以檢測宿主細胞中克隆的誘變Vip3多肽的殺蟲活性。可以從宿主細胞中回收編碼活性Vip3多肽(例如，分泌性的和通過抗體檢測的；或昆蟲生物測定中有殺蟲活性的)的誘變DNA分子，并用標準工藝方法快速測序。這些方法可以快速測定目的Vip3多肽中單個氨基酸殘基的重要性，可以應用于未知結構的多肽。可對用DNA改組方法產(chǎn)生的重組h》3基因文庫進行篩選，以鑒定顯示在用于保護植物抗害蟲方面具有改進特性的重組n力3基因?？衫肈NA改組獲得改進的h》3害蟲抗性基因特性的是有增加的抗靶害蟲的效力，增加的靶害蟲范圍，害蟲發(fā)展抗性的可能性降低，增加的表達水平，對蛋白酶降解有增加的抗性，增加的環(huán)境穩(wěn)定性和對宿主植物的毒性降低。通過利用適合的篩選策略，能同時或依次獲得對多個特性進行了優(yōu)化的h》3基因。利用DNA改組可獲得編碼毒素的rip3害蟲抗性基因，所述毒素顯示了增強的抗靶害蟲效力。一旦完成改組，即可篩選由此得到的改組n》3基因文庫，以鑒定顯示增強的殺蟲活性的^力3基因。進行該篩選的一個方法是將經(jīng)過改組的n》3基因的蛋白質編碼區(qū)域克隆進入表達載體中，所述表達載體適于在選定宿主細胞，例如大腸桿菌(f.co7i)或蘇云金芽孢桿菌(Aac/i7wsWwn'/7^'e/7SJ.s)無晶體抹系中表達所述基因。本領域技術人員將認識到利用這兩種表達系統(tǒng)的優(yōu)點和缺點。例如在產(chǎn)生分泌性Vip3蛋白質中將更期望使用蘇云金芽孢桿菌(Aac/":/s"w^'/^ie/7sis)。如果期望，可以對克隆進行初步篩選，例如通過免疫測定法，以鑒定產(chǎn)生正確大小的Vip3蛋白質的克隆。然后在功能篩選中檢測初步篩選中的陽性克隆，以鑒定編碼有期望的增強活性的毒素的改組h》3基因，完整昆蟲測定法可以用于檢測毒性。在這些測定法中，在昆蟲斜料，例如人工斜料或植物組織中放置改組n》3基因表達的Vip3毒素，并且該靶昆蟲將消耗該Vip3毒素。可以在進一步生物測定中檢測引起靶昆蟲生長抑制或死亡的這些克隆以測定效力。編碼具有增強效力的毒素的改組w》3基因可以鑒定為有降低的EC5。(降低昆蟲生長50%必需的毒素濃度)和/或LC5Q(引起50%死亡率必需的毒素濃度)的改組n》3基因。體外測定法也可以用于篩選改組"/3基因文庫。這種測定法通常包括應用對Vip3毒素敏感的培養(yǎng)昆蟲細胞和/或表達Vip3毒素受體的細胞，所述Vip3毒素或者是天然的或者是異源基因表達的結果。可以利用其它的體外測定法，例如細胞形態(tài)學改變的測定，可用于測定細胞死亡的染料和標記，或細胞ATPase釋放的測定。利用培養(yǎng)的昆蟲細胞進行Vip3毒性測定的一個適合的體外測定例子是Sf9(Spocfoptera/rwgi/e27/a)細胞。Sf9對Vip3毒素高度敏感。當混合Vip3毒素和Sf9細胞時，細胞膜變得對小分子高度通透。當向細胞懸浮液加入染料如臺盼藍時，那些被Vip3毒素殺死的細胞染色為藍色。因此，可以通過圖象分析測定Vip3毒素的細胞毒性.另一個體外測定法包括Vip3毒素受體的應用。在美國專利6,291,156中公開了這樣的一種受體，這里并其為參考文獻?？梢栽诮邮鼙砻?例如96孔板或硝化纖維素膜，但不限于此)固定Vip3受體蛋白質，并將其暴露于包含改組rip3基因的克隆。因此，可以根據(jù)對Vip3受體的結合親和性鑒定編碼功能性毒素的改組Wp3基因。而且，利用本領域已知的方法(參見，例如Clem和Miller,1194,Mol.Cel.Biol.14:5212-522),可以將編碼Vip3受體的基因轉化進入非Vip3敏感細胞系例如Schneider2(S2)果蠅細胞系中。然后，將轉化的S2細胞暴露于包含改組h》3基因的克隆。因此，可以根據(jù)細胞死亡的誘導鑒定編碼功能性毒素的改組h》3基因。實施例參考下面詳細的實施例將進一步描述本發(fā)明。僅僅為了示例目的而提供這些實施例，除了另外說明，這些實施例不意味著是限制性的。這里所用的標準重組DNA和分子克隆技術也是本領域已知的，并且Ansubel(編輯)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley和Sons,.Inc.(1994);T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborlaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1998);和T.J.Silhavy,M.LBerman，和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)描述了這些技術。實施例1:蘇云金芽孢桿菌("ac/Wwst力〃ri/^7'e/7w's)抹系AB1183粘粒文庫的構建通過在37匸用2mg/ml溶菌酶處理重懸在100邁MTrispH8，10mMEDTA中的新鮮生長的細胞30分鐘，從命名為AB1183的蘇云金芽孢桿菌(AaciWw^"7^r.e脂.s)分離總DNA。在1%SDS,50mMEDTA,1M脲中加入蛋白酶至終濃度100pg/ml，在551C溫育。加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇。輕輕混合樣品5分鐘，以3K離心。重復該步驟2次。然后用0.7體積異丙醇混合水相，離心。用70%乙醇洗DNA沉淀3次，在0.5XTE中輕輕重懸。在37t:，在100pl體積中，用0.3單位5"犯W/ngDNA處理12ngDNA。每2分鐘間隔取樣，持續(xù)10分鐘。然后加入1/10體積10XTE，在65"C加熱樣品30分鐘以滅活酶。對樣品進行電泳以測定40kb范圍的部分，并且在連接中利用該樣品。利用克隆位點，如供應商所述制備SuperCos粘粒栽體(Stratagene，LaJolla，CA)。在5yl體積中，以2:1比率將100tig/ml制備的SuperCos和事先用5^^a^消化的AB1183DNA在6"C連接過夜。如供應商所述，用GigapackXLIII(Stratagene)包裝連接混合物。如供應商所述，使包裝的噬菌體感染進入XL-1MR大腸桿菌(f.)細胞(Stratagene)。在有50pg/ml的L-瓊月旨上涂布平板粘粒文庫，在37"C溫育16小時。名t選和培養(yǎng)1200個菌落用于檢測抗昆蟲活性。實施例2:粘粒克隆的生物測定篩選實施例1的1200個菌落的抗煙坊夜蛾(^eh'ot力^srj'resce/7s)新生幼蟲的殺蟲活性。在人工姅料上，用表面污染方法進行生物測定。7天后對生物測定評分。發(fā)現(xiàn)8個克隆對煙坊夜蛾(/feJiot/a's7iresce/s)具有殺蟲、活'昧。實施例3:殺蟲活性粘?？寺〉姆治鰹榱髓b定n》3同源序列，利用Carozzi等(1991,Appl.Env.Microbiol.57:3057—3061)的方法，用來自于r/p3A基因(SEQIDNO:4)5，引發(fā)區(qū)域的引物在8個煙坊夜蛾(〃e7iot力h"'resce/zs)陽性克隆上進行PCR分析。用于該分析的引物是正向5，-GTGATCTAACCCTAGACG-3，(SEQIDNO:8)反向5，-GCTTTAGTTCCATTCACTCC-3，(SEQIDNO:外一個克隆產(chǎn)生了n力3類相關基因的預期大小的DNA條帶。將來自于該克隆的3.8kbEcoRI片段亞克隆進入pBluescript(Stratagene),轉化進入大腸桿菌(Aco7i)。用PCR分析證實了該大腸桿菌(A克隆包含">同源編碼序列。該v/p^同源編碼序列被命名為np3B。包含r/p3B編碼序列的大腸桿菌(Acoh')克隆的生物測定結果證明了Vip犯毒素與煙椅夜蛾(^eh'ot力/sWresce/s)活性有關。包含在該克隆中的質粒以及該克隆被命名為pCIB9徹。實施例4:全長w》3B基因的克隆和測序用和fco/JV切割pCIB9400以除去"》3B編碼序列3，末端附近約800bp的側翼序列。用Klenow聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.)補平由此得到的片段的末端，然后用T4連接酶(NewEnglandBiolabs，Beverly,Mass.)連接在一起。轉化該連接混合物進入大腸桿菌co7/)DH5a細胞中。用標準堿裂解方法從單菌落中分離質粒DNA,進行幾種限制性消化以確保刪除了該800bp的側翼序列。由此得到的質粒命名為pN0V1325，并且保藏在ATCC保藏號PTA-3868的大腸桿菌(&coh.)中。用雙脫氧鏈終止方法進行測序，用AppliedBiosystemsInc.模式3700自動DM測序儀(FosterCity,CA)完成測序。用GeneCodesCorporation(AnnArbor,Michigan)的Sequencher4.05裝配序歹'J。序列分析鑒定了編碼約88KDa分子量的787氨基酸蛋白質(SEQIDNO:2)的2364bp編碼序列(SEQIDNO:1)。n》3B核苷酸序列與yj》3A基因核苷酸序列有86%同一性。Vip3B蛋白質氨基酸序列與Vip3A蛋白質氨基酸序列有88%同一性。實施例5:pN0V1325和pCIB9400中表達的Vip3B蛋白質的生物測定向50,培養(yǎng)亞中傾入熔化的小地老虎斜料(BioServ，F(xiàn)renchtown，NJ)，并且使其凝固。用移液管轉移200n1含有pN0V1325或pN0V9400(每種均含有W/;3B編碼序列)的ToplO(Invitrogen，)大腸桿菌(&)細胞到飾料表面。用細菌環(huán)均一地涂抹溶液以使懸浮液覆蓋整個辨料的表面。使表面完全干燥。用極細的尖刷在斜料上放置下表列出的鱗翅目物種的第一齡期幼蟲。分開檢測每個物種。在幼蟲侵染斜料后3天和5天記錄幼蟲死亡率。用包含沒有載體的ToplO大腸桿菌(Acoh')細胞的樣品作為陰'疰對照。為了比較的目的，也可以在相同生物測定中檢測Vip3A蛋白質。對于該實施例，比較該實施例獲得的Vip3B數(shù)據(jù)和Vip3A的已知活性譜數(shù)據(jù)。表1所示的是生物測定結果。表1中所示數(shù)據(jù)是從侵染后第5天的記錄。在大腸桿菌co")陰性對照中觀察到很少活性或沒有活*逸。結果表明Vip3B毒素比Vip3A毒素有更廣譜的活性，因為Vip3B具有抗歐洲玉米螟f05^T2'/7iaM/Z^7ah、)和小菜蛾(尸7"e77aj^o^e"a)的活性。結果也表明Vip3B對谷實夜蛾(#e_/j'cop^r/azea)比Vip3A毒素有更高的比活性。表1昆蟲百分死亡率pCIB9400pN0V1325Vip3A的潘汰對照譜b:W^;^M(Manducasexta)100100010010051001001010010010十10090101001000gfc^玉絲廣Ostrj77iavju6j7ah's)1001000—1001000j^^M(7]ric力o/^usJ'a/力1001000棉紅鈴蟲(尸ec"/7C(pAoragoss_ypJ'e_ZJa)50'so-0向曰^"細巻葉蛾(CbcA/JisAaspes)60'so'0a觀察到存活的昆蟲有嚴重的進食和生長抑制。b"十"表示對Vip3A敏感的昆蟲物種，"-"表示對Vip3A凡乎沒有或完全沒有敏感性的昆蟲物種。實施例6:玉米優(yōu)化的ri/3B編碼序列的構建根據(jù)美國專利5,625,136中公開的方法制備合成的玉米優(yōu)化n》3B編碼序列。在該方法中，利用了玉米偏愛的密碼子，即最常編碼玉米中該氨基酸的單密碼子。特定氨基酸的玉米偏愛密碼子可從玉米的已知基因序列推知。在Murray等，NucleicAcidsResearch17:477-498(1989)中發(fā)現(xiàn)了玉米植物28個基因的密碼子用法。將合成的"》3B編碼序列(SEQIDNO:3)克隆進入pET101/D-Topo表達載體。命名由此得到的栽體為pN0V1328，將其轉化進入大腸桿菌(Acoh')DH5a細胞中，以ATCC保藏號PTA-3869保藏。實施例7:包含rj》3B基因的轉基因玉米植物的產(chǎn)生選擇合成的玉米優(yōu)化的ia》3B(SEQIDNO:3)編碼序列用于轉化進入玉米植物。將包含合成w》3B編碼序列的表達盒轉移到用于農桿菌(y^Tc^acten'WB)介導的玉米轉化的適合載體。構建用于該實施例的3個載體(a)包含兩個rip3B表達盒的載體，第一表達盒包含MTL:"/3B,第二表達盒包含PEPC:,(b)包含CMP:n'/^A的載體，(c)包含UbiP:^p3B的載體。用在該實施例中的所有載體也包含用于轉基因系篩選的磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因(Negrotto等，(2000)PlantCellReports19:(798-803)。將所有3個載體分別轉化進入玉米中?；救鏝egrotto等，(2000)PlantCellReports19:798-803所述進4f未成熟玉米胚的轉化。對于該實施例，所有培養(yǎng)基組分都如上文Negrotto等中所述。然而，可以替換本領域已知的各種培養(yǎng)基組分。在28X:,在YEP(酵母提取物(5g/L),蛋白胨(10g/L)，NaCl(5g/L),15g/L瓊脂，pH6.8)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)包含植物轉化質粒的農桿菌Ug7^6acteri咖)抹系LBA4404(pSB1)2-4天。在補充了擺pMAs(Negrotto等，(2000)PlantCellR印19:798-803)的LS-inf培養(yǎng)基中懸浮大約0.8xl()9個農桿菌U^(^a"er/咖)。在該培養(yǎng)基上預誘導細菌30-60分鐘。從8-12日齡的穗切下A188未成熟胚，放入液體LS-inf+100PMAs中。也可以利用其它玉米生殖質的未成熟胚形式。用新鮮感染培養(yǎng)基潤洗胚一次。然后加入農桿菌0^ro6a"e2^咖)溶液，渦旋胚30秒，使其和細菌共存5分鐘。然后，將胚以小盾片側朝上的方向轉移到LSA培養(yǎng)基中，在黑暗中培養(yǎng)2到3天。隨后，按每個培養(yǎng)皿20到25個胚的方式將胚轉移到補充了頭孢噻坊(250mg/l)和硝酸銀(1.6mg/l)的LSDc培養(yǎng)基中，在28TC黑暗中培養(yǎng)約10天'將產(chǎn)生胚性愈傷組織的未成熟胚轉移到LSD1M0.5S培養(yǎng)基中。在該培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)物約6周，同時在約3周進行傳代培養(yǎng)步驟。轉移存活的愈傷組織到補充了甘露糖的Regl培養(yǎng)基中。在光中(16小時光/8小時黑暗管理)培養(yǎng)后，轉移綠色組織到?jīng)]有生長調物的Reg2培養(yǎng)基上，溫育約1-2周。將小植物轉移到含有Reg3培養(yǎng)基的MagentaGA-7盒(MagentaCorp，Chicago111.)中，在光下生長。約2-3周后，通過PCR檢測植物中PMI基因和Ta》3B基因的存在。PCR檢測為陽性的植物轉移到溫室，檢測對鱗翅目害蟲的抗性。實施例8:表達Vip3B的轉基因玉米植物的分析昆蟲的生物測定當從MagentaGA-7盒移植植物到土壤中時，從植物取樣。取樣包括切下兩小片葉片(大約2-4cin長)，放置每片葉片在小培養(yǎng)m中。陰性對照或者是來自于相同轉化試驗的n》3B基因呈PCR陰性的轉基因植物，或者是同轉基因植物在類似生長條件下生長的(與檢測植物有相似大小的)非轉基因植物。通過在每個葉片上放置10只第一齡幼蟲，用歐洲玉米螟rOstri/^.avVwZ^7aJj's)或秋粘蟲(5^ot/o/tejra/iT/g/percfa)接種每個植物的葉片樣品。然后，嚴密地密封培養(yǎng)皿。也可以利用其它適合的昆蟲害蟲。在接種約3-4天后，收集數(shù)據(jù)。計算幼蟲的百分死亡率。同時可以確定葉片的可視損害等級。喂食損害分級為高級，中級，低級或沒有，數(shù)值分別為3，2，l或0。表2所示是轉基因植物的生物測定結果。結果表明包含Wp3B基因和表達Vip3B蛋白質的轉基因玉米植物對歐洲玉米螟rOs^ri/iayVtf&'7ah's)和秋粘蟲(5/70f/optera/rtfg/percfe)具有殺蟲活性'表2表達Vip3B的轉基因玉米植物的效力<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>aFAW=秋祐蟲aECB二歐洲玉米螟ELISA測定用ELISA測定各種轉基因玉米組織中Vip3B蛋白質的水平。根據(jù)美國專利5，625,l加中公開的方法進行了ELISA分析。表3所示的是ELISA分析的結果。表3轉基因玉米中Vip3B蛋白質的水平指定組織4tVip3B蛋白質平均水平(ng/貝g可溶性蛋白)事件葉片木號外皮花粉118A20±120.316=*0.2400.686勸，6450121A20±190.523勸.3870.723勸.3430142C18±171.12巧.7703.75±1.300145B19±130.720巧.7202.23《.00實施例9:雜合Vip3毒素Vip3B對歐洲玉米螟f6^trj7j'aA^^7ah's)和小菜蛾(/l"e77a177os&77a)是有毒性的，而相關的Vip毒素Vip3A幾乎沒有或完全沒有活性。Vip3B和Vip3A主要不同在于它們各自氨基酸序列的C-末端區(qū)域，特別是SEQIDNO:2氨基酸579到氨基酸787區(qū)域。為了證明Vip3B的該C-末端區(qū)域是Vip3B毒素中足夠提供抗歐洲玉米螟fOsW/j'a和小菜蛾(尸7"e"aij^o"e^a)的活性的部分，構建了一種雜合毒素，其中包含由SEQIDNO:2氨基酸579開始、氨基酸787終止的Vip3BC-末端區(qū)域以及按從氨基到羧基方面連接的由SEQIDN0:5氨基酸1開始、氨基酸578終止的Vip3AN-末端區(qū)域。命名該雜合毒素為Vip3A-B(SEQIDNO:7)用下面引物，利用兩步PCR構建編碼Vip3A-B雜合毒素的核酸分子VIP3A-:N:5,■ATGACCAAGAATAATACTAAATTAAGCAC-3,(SEQIDNO:10)VlPftis4:5,-TCCTTATGAACATATAAAGCTTTAGTTCCATT-3,(SEQIDNO:11)VIP3B《:5，GGCGAATTC^CAC^^AATCGAAAAATTCCGGAAATTTAT-3,(SEQIDNO:12)yiPfus3;5,-AATGGAACTAAAGCTTTATAT<3TTCATAAGOA-3,(SEQIDNO:13)在第一步PCR中，用引物Vip3A-N(SEQIDNO:10)和Vipfus4(SEQIDNO:11)產(chǎn)生編碼N-末端區(qū)域的Wp3A基因5，末端約1.7kb的片段，用引物VipB—C(SEQIDNO:12)和Vipfus3(SEQIDNO:13)產(chǎn)生編碼C-末端區(qū)域的w》3B基因3，末端約0.7kb的片段。在第二步PCR中，聯(lián)合這兩個片段作為引物Vip3A-N(SEQIDNO:10)和Vip3B-C(SEQIDNO:12)的模板以產(chǎn)生約2.4kb的雜合一3A-"》3B基因，命名為"WA-B(SEQIDNO:6)。用實施例5概述的方法，檢測表達雜合Vip3A-B毒素的大腸桿菌(coh')克隆的抗秋軲蟲和歐洲玉米螟殺蟲活性。一些生物測定的結果表明，Vip3B的C-末端區(qū)域足以賦予雜合毒素以歐洲玉米螟活性.實施例10:通過DNA改組的rj》3基因的體外重組通過PCR擴增本發(fā)明的kj》3基因之一，例如SEQIDN0:1,3，或6?；救鏢temmer等，/WAS*91:10747-10751(1994)所述，通過Dnasel處理消化由此得到的DNA片段，從反應混合物除去PCR引物。如Stemmer等(1994)所述，進行沒有引物的PCR反應，隨后進行有引物的PCR反應。將由此得到的DNA片段克隆進入pTRC99a(Pharmacia,目錄號27-5007-01),利用Biorad基因脈沖發(fā)生器和制備商的條件，通過電穿孔轉化進入大腸桿菌(f.cc^y)抹系SASX38。在培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)轉化的細菌，篩選殺蟲活性。在相似的反應中，使包含本文所述n力3基因之一(SEQIDNO:1,3,或6或其突變體)的PCR擴增DNA片段和包含至少一個本文所述的其它vip3基因的PCR擴增DNA片段(或其突變體)發(fā)生體外重組，如下所述回收由此得到的具有改進殺蟲特性的變體。為了增加改組ia》3基因文庫的多樣性，利用合成寡核苷酸改組對一個或多個h》3基因(稱為初級基因)進行改組。合成對應于至少一個多樣性區(qū)域的大量(例如，2，5,10,20，50，75，或100或更多)寡核苷酸?？梢灾苯訉@些寡核苷酸改組，或可以與該核酸家族的一種或多種重組。可以從稱為次級基因的其它n力3基因獲取寡核苷酸序列。次級基因與初級基因有一定程度的同源性。有幾種選擇用于寡核苷酸合成的次級基因部分的方法。例如，可以隨機選擇次級基因的部分。DNA改組方法將選擇那些可以引入到改組基因中的寡核苷酸。只要選定的部分適合合成，它們可以是任何長度。也可以根據(jù)初級和次級基因之間的同源性設計寡核苷酸。一定程度的同源性對于改組期間必需發(fā)生在DNA片段間的交換是必要的。同時，強的異質性對于改組基因文庫的多樣性也是需要的。而且，根據(jù)蛋白質序列知識和功能關系，可以選擇用于寡核苷酸合成的次級基因特定部分。本發(fā)明公開了Vip3B的C-末端結構域部分地與Vip3毒素的活性譜有關。當利用DNA改組技術，通過本發(fā)明#^飾殺蟲譜時，可以選擇次級基因核普酸序列的C-末端區(qū)域作為把區(qū)域用于合成寡核普酸改組方法中應用的寡核普酸。因為Vip3蛋白質的殺蟲活性至少部分地依賴于N-末端區(qū)域，可以選擇次級基因的N-末端區(qū)域進行寡核苷酸改組，以增加殺蟲活性。實施例11:高處理量篩選殺蟲活性篩選大腸桿菌(Aco_/i)或者蘇云金芽孢桿菌(Aac/^wst力〃ri/^/e/7s/s)中改組"/3基因文庫的殺蟲活性。用Q-bot(Beckman)挑出菌落，放在標準96孔規(guī)格板中的生長培養(yǎng)基中，過夜生長。然后，以96孔規(guī)格將每個克隆鋪到昆蟲斜料表面上，使表面干燥?？蛇x地，向每個孔加入轉化細胞群以增加起始篩選循環(huán)中檢測的克隆數(shù)。例如，每孔篩選100個克隆，利用10000個孔可進行106個克隆的篩選。向每個孔加入幾種新生耙昆蟲幼蟲，例如煙坊夜蛾(^eh'c^力J's"'jresce/7s)，谷實夜蛾(Zfe7i"corer/a或秋祐蟲(&o^/o/tejra。用透氣膜包裹該板，以使幼蟲保留在所放置的孔中。5天后，對各孔評估消耗辨料的量和/或昆蟲死亡率。選擇顯示幾乎沒有或完全沒有消耗餅料和/或觀察到高昆蟲死亡率的孔中的克隆用于進一步分析。應該能發(fā)現(xiàn)有增強的抗靶昆蟲活性的幾個克隆。所屬領域普通技術人員的技術水平。這里單獨并具體地并入所有出版物和專利申請為參考文獻。應該理解這里所述的實施例和實施方式僅僅是示例目的，本領域技術人員能夠理解在其基礎上的各種修飾或改變，這樣的內容都包括在該申請精神和范圍內及所附權利要求范圍內。序列表<110>Miles,PaulKramer,VanceShen,ZhichengShotkoski,FrankWarxen,Greg<120>新型殺蟲毒素<130>S-60000P1<160>13<170>Patent工nversion3,0<210>1<211>2364<212>DMA<213>蘇云金芽孢桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(2364)<223>天然vip犯編碼序列<400>1atgaacaagaataatactaaattaaacgcaagggccttsccgagttttMetAsnLysAsnAsnThrLysLeuAsnAlaArgAlaLeuProSerPhe151015attgattattttaatggcatttatggatttgccactggtateaaagaclieAspTyrPheAsnGly工leTyrGlyPheAlaThrGlylieLysAsp202530attatgaacatgatttttaaaacggatacaggtggaaatetaaccetalieMetAsnMetliePheLysThrAspThrGlyGlyAsnLeuThrLeu354045:144gacgaaattttaaaaaatcagcagttaAspGlulieLeuLysAsnGinGinLeu5055ttaaatgagatttctggtaaaLeuAsnGlulieSerGlyLys60192ttggatggggtaaatggg-agettaaacgatcttategcacagggaaacLeuAspGlyValAsnGlySerLeuAsnAspLeulieAlaGinGiyAsn65707580240ttaaatacagaattatctaaggaaatettaaaaattgcaaatgagcagleuAsnThrGluLeuSerLysGlulieLeuLys工leAlaAsnGluGin859095288aatcaagtctta站tgatgttaataacaaacttaatgcgataaatacaAsnGinValLeuAsnAspValAsnAsnLysLeuAsnAlalieAsnThr100105110336atgcttcacatatatctncctaaaattacatctatgttaoat。atgtaMetLeuHis工leTyrLeuProLyslieThrSerMetLeuAsnAspVal115120125384atgaaacaaaattatgcaetaagtctgcaaatagaatacetaagtaaaMetLysGinAsnTyrAlaLeuSerLeuGinlieGluTyrLeuSerLys130135140432caattgcaagaaatttecgacaagttagatgtcattaacgtgaatgtaGinLeuGinGlulieSerAspLysLeuAspVallieAsnValAsnVal145150155160480ctt3ttaactctacacttactgaaattacacctgcgtatcaaeggdtgLeu工leAsnSerThrLeuThrGlulieThrProAlaTyrGinArgMet16517017552BaaatatgtaaatgaaaaatttgaagatttaacttttgetacagaaaccLysTyrValAsnGluLysPheGluAspLeuThrPheAlaThrGluThr1801B5190576actttaaaagtaaaaaagaatageteccctgcagatattcttgatgagThrLeuLysValLysLysAsnSerSerProAlaAsp工leLeuAspGlu195200205624ttaactgagttaactgaaetagcgaaaagtgttxacaaaaaat卯cgtgLeuThrGluLeuThrGluLeuAlaLysSerValThrLy曰AsnAspVal210215220672gatggt.tttgaattttaccttaatacattccacgatgtaatggtaggaAspGly'PheGluPheTyrLeuAsnThrPheHisAspValMetValGly225230-235240720aacaatttattcgggcgtteagetttaaaaactgetteggaattaateAsnAsnLeuPheGlyArgSerAlaLeuLysThrAlaSerGluLeulie245250255760getamjjasaatcftootrnacaaatoacoatCrtaoonnafctftttntAlaLysGluAsnValLy曰ThrSarGlySarGluValGlyAunVeilTyr260265270B16aatttcttaattgtattaAsnPheI*eulieValLeu275acagetctgcaagca幼agettttcttactThrAlaleuGinAlaLysAlaPhelieuThr28028《864ttaacaacatgcegga貼ttattaggcttagesgatattgattatactLeuThrThrCysArgLysLeuLeuGlyLeuAlaAsplieAspTyrThr290295300ttcattatgaatgaacatPhe工leMetAsnGluHis305310ttagataaggaaa站gaggaatttagagtaLeuAspLysGluLysGluGluPheArgVal315320912960aatatecttcctacacttAsnlieIeuProThrlieu325tctaatactttttctaatcctaactatgcaSerAsnThrPheSerAsnProAsnTyrAla3303351008eiaageta站ggaageaatg站gatgcaaagataattgtgg站getaaaLysAlaLysGlySerAsnGluAspAlaLyslielieValGluAlaLys3403453501056ccaggatatgetProGlyTyxAla355ttggttggatttgaaatgageaatgatteaateacaLeuValGlyPheGluMetSerAsnAspSer工leThr3603S51104gtattaaaagcatatcaggetaagetaaaacaagattatcaagttgatValLeuLysAlaTyrGinAlaLysLeuLysGinAsprr*yxGinValAsp3703753801152aaagattegttateagaaattgtctatggtgatatggataaattattgLysAspSerLeuSerGlu工leValTyrGlyAspMetAspLysLeuLeu3853903954001200tgcccggatcaatctgaacaaatatattatacaaataacattgettttCysProAspGinSe;rGluGin工leTyrTyrThrA曰rxAsnlieAlaPho4054104151248cccaatgaatatgtaattactaaaattacttttProAsnGluTyrVallieThrLyslieThrPhe,420425actaaaaaaatgaatThrLysLysMetAsn4301296agtttaagatatgaggcaacagetaatttttatSerLeuArgTyrGluAlaThrAlaAsnPheTyr435440gattcttctacagggAspSerSerThrGly4451344gatattgatetaaataagacaaaagtaAsplieA印LauAanLy曰ThrLyaVal450455gaatea叩t。bqtfCBtatGlufloirClluAlaM'yr460agtacgetaagtge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b)與(a)的核苷酸序列屬同類編碼的；或(c)編碼與SEQIDNO:2有至少91%序列同一性的氨基酸序列。20.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列與SEQIDNO:1中所示核苷酸序列有至少92%序列同一性。21.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列與SEQIDNO:1中所示核苷酸序列有至少95%序列同一性。22.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列與SEQIDNO:1中所示核苷酸序列有至少99%序列同一性。23.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1中核苷酸1-2364。24.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列與同SEQIDNO:1有至少92%序列同一性的核苷酸序列屬同類編碼。25.如權利要求24所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO:3的核苷酸1-2364。26.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼與SEQIDNO:2有至少91%序列同一性的氨基酸序列。27.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼與SEQIDNO:2有至少95%序列同一性的氨基酸序列。28.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼與SEQIDNO:2有至少99%序列同一性的氨基酸序列。29.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼SEQIDNO:2中所示氨基酸序列。30.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含pN0V1325(ATCCPTA-3868)中所含的約2.4kbDNA片段。31.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含pNOV1328(ATCCPTA-3869)中所含的約2.4kbDNA片段。32.如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中所迷毒素具有抗鱗翅目昆蟲的活性。33.如權利要求32所述的分離的核酸分子，其中所述鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)，小菜蛾(Plutellaxylostella),秋粘蟲(Spodopterafrugiperda)，小地老虎(Agrotisipsilon)，谷實夜蛾(Helicoverpazea),煙奸夜蛾(Heliothisvirescens)，貪夜蛾(Spodopteraexigua),細點突夜蛾(Helicoverpapunctigera),棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera),煙草天蛾(Manducasexta)，粉斑夜蛾(Trichoplusiani)，棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)和向曰葵細巻葉蛾(Cochylishospes)。34.包含可搡作地連接了權利要求19所述核酸分子的異源啟動子序列的嵌合基因。35.包含權利要求34所述嵌合基因的重組載體。36.包含權利要求34所述嵌合基因的轉基因宿主細胞。37.包含權利要求34所述嵌合基因的動物病毒。38.包含權利要求34所述嵌合基因的植物病毒。39.如權利要求36所述的轉基因宿主細胞，其是細菌細胞。40.如權利要求36所述的轉基因宿主細胞，其是酵母細胞。41.如權利要求36所述的轉基因宿主細胞，其是植物細胞。42.包含權利要求41所述轉基因植物細胞的轉基因植物。43.如權利要求42所述的轉基因植物，其中所述植物選自高粱，小麥，向日葵，番茄，甘藍作物，棉花，水稻，大豆，甜菜，甘蔗，煙草，大麥，油籽油菜和玉米。44.如權利要求43所述的轉基因植物，其中所述植物是玉米植物。45.來源于權利要求42所述轉基因植物的轉基因種子。46.來源于權利要求44所述玉米植物的轉基因種子。47.生產(chǎn)具有抗昆蟲活性的毒素的方法，包括(a)獲得權利要求36所述轉宿主宿主細胞；和(b)在所述細胞中表達核酸分子，產(chǎn)生至少一種具有抗昆蟲活性的毒素。48.生產(chǎn)抗昆蟲的轉基因植物的方法，包括將權利要求19所述核酸分子引入所述轉基因植物中，其中所述核酸分子可在所述轉基因植物中以控制昆蟲的有效量表達。49.如權利要求48所述的方法，其中所述昆蟲是鱗翅目昆蟲。50.如權利要求49所述的方法，其中所述鱗翅目昆蟲選自歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)小菜蛾(Plutellaxylostella)，秋黏蟲(Spodopterafrugiperda),小地老虎(Agrotisipsolon),谷實夜蛾(Helocpverpazea)，煙奸夜蛾(Helisthisvirescens),貪夜蛾(Spodopteraexigua)，細點突夜蛾(Helicoverpapunctigera)，棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)，煙草天蛾(Manducasecta),粉斑夜蛾(Trichoplusiani)，棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)和向曰葵細巻葉蛾(Cochylishospes)。全文摘要本發(fā)明公開了一種高度抗廣譜鱗翅目昆蟲害蟲的新的殺蟲毒素?？梢岳镁幋a該殺蟲毒素的DNA轉化各種原核生物和真核生物以表達所述殺蟲毒素。還可以在各種環(huán)境中利用這些重組生物體控制鱗翅目昆蟲。文檔編號A01NGK101385467SQ200810169350公開日2009年3月18日申請日期2002年4月1日優(yōu)先權日2001年3月30日發(fā)明者F·肖特科斯基,G·W·沃倫,P·邁爾斯,V·克拉默,沈志誠申請人:辛根塔參與股份公司