專利名稱：一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸青貯飼料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)共軛亞油酸(CLA，Conjugated linoleic acid)的新菌株及利用其發(fā)酵生產(chǎn)富含CLA的功能性青貯飼料。
背景技術(shù)：
共軛亞油酸(CLA)具有抗癌、促進(jìn)生長(zhǎng)、抑制脂肪累積、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等功能，能提高豬、禽生長(zhǎng)速度和瘦肉率，是當(dāng)前藥物、保健食品和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)等學(xué)科的研究熱點(diǎn)。美國(guó)NRC已把CLA列為唯一具有抗癌作用的動(dòng)物源脂肪酸。CLA至少存在4種異構(gòu)體，“Cis-9，trans-11-亞油酸”是CLA中最主要、最具活性的一種異構(gòu)體。牛奶和牛肉、羊肉等反芻動(dòng)物食品中90％以上的CLA都是“Cis-9，trans-11-亞油酸”，是人類最主要的CLA天然來源。
因此，CLA含量高的牛奶被稱為功能性牛奶，CLA含量高的牛肉、羊肉被稱為功能性食品。目前，人們通過二種日糧營(yíng)養(yǎng)調(diào)控途徑來提高反芻動(dòng)物奶、肉中CLA含量一是日糧添加油脂或改變?nèi)占Z脂肪來源，以增加瘤胃中CLA代謝底物亞油酸的含量，進(jìn)而提高畜產(chǎn)品中CLA含量；二是直接添加CLA或瘤胃保護(hù)CLA(即過瘤胃CLA)。但由于CLA價(jià)格昂貴， 飼料中添加成本過高，生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用不多。因此，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料學(xué)家正在尋求其它提高畜產(chǎn)品中CLA含量的適用、低成本方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是旨在克服上述直接添加共軛亞油酸和改變?nèi)占Z脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的不足，提供一種能夠高產(chǎn)共軛亞油酸的植物乳桿菌新菌株及利用其發(fā)酵制備富含共軛亞油酸青貯飼料的方法，以提高反芻動(dòng)物日糧中共軛亞油酸的含量。
本發(fā)明的植物乳桿菌新菌株系從自玉米青貯中分離、篩選、純化和培育出來，命名為植物乳桿菌ANCLA01(Lactobacillus plantarum ANCLA01)。
該植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸青貯飼料的方法是先將該高產(chǎn)共軛亞油酸的菌株ANCLA01批量擴(kuò)培后，再重新回接到玉米、胡蘿卜、苜蓿和甜菜等青貯中，使植物油脂中的亞油酸發(fā)酵轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸。
圖1為本發(fā)明的植物乳桿菌ANCLA01在顯微鏡下拍攝的照片；圖2為本發(fā)明的植物乳桿菌ANCLA01菌株P(guān)CR擴(kuò)增條帶照片；圖3為不同菌株生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的能力；圖4為植物乳桿菌ANCLA01對(duì)發(fā)酵底物中碳水化合物的利用。
本發(fā)明的植物乳桿菌ANCLA01(Lactobacillus plantarum ANCLA01)已按規(guī)定進(jìn)行了保藏保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱為CGMCC；地址中國(guó).北京.中關(guān)村，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2007年1月8日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCCNo.1906。
具體實(shí)施例方式1.材料與方法1.1材料玉米青貯采集于合肥市白帝乳業(yè)發(fā)展公司；培養(yǎng)基pH6.5-6.8，MRS肉湯培養(yǎng)基，PY培養(yǎng)基，MRS固體培養(yǎng)基、MRS半固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基和補(bǔ)添0.1g(100ml)-1LA的MRS液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基用前均于121℃高壓蒸汽下滅菌20min。
1.2主要試劑LA和CLA純度≥99％，購(gòu)自Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑盒和膠回收試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；其它試劑均為分析純。
1.3菌種篩選1.3.1初篩采集青貯后立即選取感官指標(biāo)較好的青貯枝葉浸入37℃雙蒸水中，十分鐘后去除枝葉，吸取新鮮均勻浸泡液10mL加到500ml裝有300mL MRS肉湯培養(yǎng)基的三角燒瓶中。37℃靜止增菌96h后，稀釋涂布平板法傾倒MRS瓊脂平板，四區(qū)劃線后于37℃厭氧培養(yǎng)48h，挑取單菌落穿刺接種于MRS半固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)后防于冰箱保存。
1.3.2復(fù)篩將初篩保存菌種于37℃活化后，按5％的接種量接種于裝有10mL MRS液體培養(yǎng)基的帶螺帽試管(d18mmx160mm)中，其中MRS液體培養(yǎng)基中亞油酸含量為0.1g(100mL)-1。N2驅(qū)除空氣，厭氧發(fā)酵24h后測(cè)定CLA，以篩選出產(chǎn)CLA細(xì)菌。
1.4 CLA測(cè)定以正己烷為溶劑，將CLA標(biāo)樣配成不同濃度的溶液，以正乙烷為參比，在233nm處測(cè)定其吸收值，以CLA濃度(ug/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵液中CLA的提取按Jiang等(1998)方法操作。之后，將所獲得脂肪酸提取物用5mL正己烷溶解，以不接種的發(fā)酵液提取物為參比，用紫外分光光度計(jì)再00-350nm范圍內(nèi)掃描，讀取特征吸收峰233nm處的吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中CLA的含量(Pariza等，1999)。參比培養(yǎng)基加入與樣品同量的亞油酸，不接菌種，其它步驟同樣品。
1.5菌種鑒定1.5.1菌落及形態(tài)觀察將獲得的高產(chǎn)菌株活化后，通過四區(qū)化線法接種于MR5平板培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)24h后觀察菌落特征。革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征、長(zhǎng)度范圍和寬度范圍等。
1.5.2生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版(1994)，對(duì)獲得的共軛亞油酸高產(chǎn)菌株進(jìn)行接觸酶反應(yīng)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫反應(yīng)、吲哚反應(yīng)、溫度生長(zhǎng)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步鑒定。從葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)及甘露糖、棉子糖等生理和生化方面進(jìn)行分類鑒定，實(shí)驗(yàn)參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版(1994)乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行具體操作。
1.5.3分子生物學(xué)鑒定模板的制備、菌株16SrDNA的PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳后目的片段的回收與純化均按試劑盒說明步驟操作。然后將回收到的目的片段送至由寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果運(yùn)用BLAST軟件與GenebanK中已登陸細(xì)菌的16SrRNA序列比較，找到與其相似性最高的登陸菌株序列號(hào)并調(diào)出其登陸粗劣，進(jìn)行差異比較。
2.結(jié)果2.1菌種的篩選去除空氣條件下發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，共分離出17株生成CLA能力較強(qiáng)的菌株。由表1結(jié)果可知，分離出的菌株CLA生成量在4.316-33.442ug/mL(濕基)之間，其中12號(hào)菌株CLA產(chǎn)量最高為33.442ug/mL。該菌株被命名為ANCLA01。
2.2菌種鑒定2.2.1菌種的菌落及形態(tài)觀察ANCLA01號(hào)菌株MRS固體培養(yǎng)后觀察發(fā)現(xiàn)，菌落凸起、圓形、表面光滑并呈白色；如圖1所示，革蘭氏染色后油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ANCLA01號(hào)菌株呈革蘭氏陽性，菌體短直、兩端鈍圓，無芽孢，菌體寬在0.9～1.1um范圍，長(zhǎng)在2～7um范圍內(nèi)，菌體間成單體、隊(duì)列或短鏈狀。因此，ANCLA01號(hào)菌落形態(tài)與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中所描述的植物乳桿菌形態(tài)特征較為一致。
2.2.2生理生化檢驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)表明，ANCLA01號(hào)菌株葡萄糖發(fā)酵結(jié)果無氣體產(chǎn)生；生長(zhǎng)溫度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株15℃能增殖發(fā)育，45℃基本不生長(zhǎng)；乳酸生成檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中有乳酸生成。兼顧上述菌株形態(tài)特征，表明該菌屬同型發(fā)酵B型乳酸桿菌。
2.2.2分子生物學(xué)鑒定菌株差異比較發(fā)現(xiàn)，ANCLA01菌株16SrRNA序列的第5個(gè)堿基以后的1482個(gè)堿基序列與Lactobacillus plantarum strain L5的第26個(gè)堿基后的1482個(gè)堿基序列完全相同(序列已上傳GenBank，登陸號(hào)EF185922)。該結(jié)果證實(shí)ANCLA01號(hào)菌株確系植物乳桿菌。
2.3不同油脂添加量對(duì)植物乳桿菌ANCLA01青貯中CLA產(chǎn)量的影響將玉米秸等青貯原料鍘至1～3cm，一邊將青貯原料堆壓在青貯塔、窖或袋中，一邊按8×107CFU/g鮮樣噴灑乳酸培養(yǎng)液(或200g/t鮮樣)的前提下，葵花籽油添加量分別按2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0kg/t鮮樣(菜籽油或花生油添加量按5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0kg/t鮮樣)添加植物油脂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葵花籽油添加量5kg/t鮮樣或菜籽油或花生油添加量8.0kg/t時(shí)，CLA產(chǎn)量最高，達(dá)到7.22mg/g(DW基礎(chǔ))。結(jié)果表明，葵花籽油最佳添加量為5kg/t鮮樣，菜籽油或花生油最佳添加量為8kg/t鮮樣。
2.4.不同乳酸菌接種量對(duì)植物乳桿菌ANCLA01青貯中CLA產(chǎn)量的影響將玉米秸等青貯原料鍘至1～3cm，一邊將青貯原料堆壓在青貯塔、窖或袋中，一邊劑量按5kg/t鮮樣添加葵花籽油，一邊接種乳酸菌。乳酸菌接種劑量按2×107CFU/g、3×107CFU/g、4×107CFU/g、5×107CFU/g、6×107CFU/g、7×107CFU/g鮮樣(或乳酸菌培養(yǎng)液50、75、100、125、150、175g/t鮮樣)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸菌接種量超過4×107CFU/g鮮樣時(shí)，青貯中CLA產(chǎn)量達(dá)到8.84mg/g(DW基礎(chǔ))后不再明顯增加，表明乳酸菌最佳接種量為4-6×107CFU/g鮮樣(或乳酸菌培養(yǎng)液100-150g/t鮮樣)。
利用該植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸青貯飼料的方法1)對(duì)植物乳桿菌ANCLA01菌株進(jìn)行批量擴(kuò)培用上述MRS液體培養(yǎng)基將保存菌株活化兩次后，接種于250mL三角瓶中，每瓶裝液量100mL，37℃恒溫靜置培養(yǎng)48～72h后，再按2×107CFU/mL添加濃度添加到液態(tài)種子發(fā)酵罐中，混合均勻后于37℃條件下培養(yǎng)發(fā)酵48h。
2)在青貯飼料中接種植物乳桿菌ANCLA01將玉米秸等青貯原料鍘至1～3cm，一邊將青貯原料堆壓在青貯塔、窖或袋中，一邊噴灑經(jīng)上述擴(kuò)培后的植物乳桿菌ANCLA01液和植物油脂；植物乳桿菌ANCLA01接種劑量按4-6×107CFU/g鮮樣(或乳酸菌培養(yǎng)液添加量為100-150g/t鮮樣)，葵花籽油添加量為5kg/t鮮樣(菜籽油或花生油添加量為8kg/t鮮樣)；最后將青貯塔、窖或袋壓實(shí)密封；青貯自然發(fā)酵40-60d后即可啟用，經(jīng)實(shí)測(cè)CLA含量均超過7.52mg/g(DW基礎(chǔ))以上。
權(quán)利要求
1.一種植物乳桿菌ANCLA01，其特征在于所述的菌株為L(zhǎng)actobacillusplantarum ANCLA01，該菌株保藏登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCCNo.1906。
2.一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸青貯飼料的方法，其特征在于1)對(duì)植物乳桿菌ANCLA01菌株進(jìn)行批量擴(kuò)培用MRS液體培養(yǎng)基將保存菌株活化兩次后，接種于250mL三角瓶中，每瓶裝液量100mL，37℃恒溫靜置培養(yǎng)48～72h后，再按2×107CFU/mL添加濃度添加到液態(tài)種子發(fā)酵罐中，混合均勻后于37℃條件下培養(yǎng)發(fā)酵48h；2)在青貯飼料中接種植物乳桿菌ANCLA01一邊將青貯原料堆壓在青貯塔、窖或袋中，一邊噴灑經(jīng)上述擴(kuò)培后的植物乳桿菌ANCLA01液和植物油脂；最后將青貯塔、窖或袋壓實(shí)密封；青貯自然發(fā)酵40-60d后即可啟用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸青貯飼料的方法，其特征在于所述植物乳桿菌ANCLA01接種劑量按4-6×107CFU/g鮮樣或乳酸菌培養(yǎng)液添加量為100-150g/t鮮樣。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸青貯飼料的方法，其特征在于所述植物油脂為葵花籽油、菜籽油或花生油。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸青貯飼料的方法，其特征在于所述葵花籽油添加量為5kg/t鮮樣。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸青貯飼料的方法，其特征在于所述菜籽油或花生油添加量為8kg/t鮮樣。
全文摘要
一種植物乳桿菌發(fā)酵制備富含共軛亞油酸青貯飼料的方法屬微生物和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的菌株(Lactobacillus plantarumANCLA01)于2007年1月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCCNo.1906。植物乳桿菌ANCLA01系自玉米青貯中分離、篩選、純化培育出來，命名為植物乳桿菌ANCLA01(Lactobacillus plantarum ANCLA01)。該植物乳桿菌ANCLA01應(yīng)用于青貯飼料，可以提高青貯飼料中共軛亞油酸的含量，生產(chǎn)出富含共軛亞油酸的功能性青貯飼料。
文檔編號(hào)A23K1/14GK101020895SQ20071001965
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2007年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月24日
發(fā)明者程茂基, 杜波, 王力生, 計(jì)峰, 蔡?，? 陳麗娟 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)