專利名稱：：實(shí)體器官移植慢性排斥的預(yù)防的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于實(shí)體器官移植領(lǐng)域，特別的，屬于預(yù)防所述移植器官免疫介導(dǎo)的排斥的更有效的方法。
背景技術(shù)：
：實(shí)體器官移植的成功受限于宿主免疫系統(tǒng)對(duì)移植器官的排斥。急性移植排斥是指移植后立即發(fā)生的免疫反應(yīng)，慢性排斥是指長(zhǎng)期的排斥，其特征是同種異體反應(yīng)性抗體的形成、白細(xì)胞浸潤(rùn)和積累的移植動(dòng)脈病，正如在心臟移植中看到的那樣。盡管全身的整體免疫抑制能用來預(yù)防器官排斥，但是這樣的整體免疫抑制使受治者暴露于被感染、癌癥(諸如血癌)和包括骨質(zhì)疏松、高血壓、肥胖、糖尿病、傷口愈合困難、庫(kù)興氏癥、情緒波動(dòng)、骨髓抑制、肝功能障礙、脫發(fā)、腎毒性、心肌癥、胃腸問題在內(nèi)的其它不希望的并發(fā)癥的可能中，特別是當(dāng)長(zhǎng)期應(yīng)用整體免疫抑制來抗擊慢性排斥時(shí)。對(duì)避免慢性排斥的改良實(shí)體器官移植方法的需求是存在的。IL-10是一種免疫抑制調(diào)節(jié)因子，它在外周T細(xì)胞耐受中扮演了重要的角色。已經(jīng)表明，IL-10使細(xì)胞因子的生產(chǎn)從Thl轉(zhuǎn)變?yōu)門h2，而Th2與長(zhǎng)期存活的器官移植相關(guān)。通過抑制Thl分化細(xì)胞因子IL-12的合成，IL-10阻塞了T1的發(fā)展、細(xì)胞因子INF-Y和IL-2的生產(chǎn)，并因此阻止了潛在的CTL反應(yīng)產(chǎn)生的移植破壞。也已經(jīng)證明，IL-10也能通過Fas/FasL途徑促進(jìn)同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞的凋亡,這是移植器官存活的機(jī)制之一。另外，IL-10下調(diào)MHC類型II和APC的輔刺激因子CD40、CD80和CD86的表達(dá)。因此，在IL-10存在時(shí)帶同種抗原的T細(xì)胞的反復(fù)刺激誘發(fā)了能產(chǎn)生具抑制活性的IL-10和TGF-P的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并導(dǎo)致了移植排斥的預(yù)防。IL-10基因治療已經(jīng)在各種移植模型(表l)中得到檢驗(yàn)。表l中的數(shù)字是指描述相關(guān)研究的參考文獻(xiàn)。表l器官移植中IL-10基因治療實(shí)驗(yàn)(引用的文獻(xiàn))<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>使用編碼IL-10的質(zhì)粒DNA和腺病毒載體的研究已經(jīng)證明了IL-10在急性移植排斥中的有效性。然而，從諸如腺病毒、皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等質(zhì)?；虿《据d體獲得的IL-10表達(dá)由于在移植中受限的基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率和短暫的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在延長(zhǎng)同種異體移植中僅取得了有限的成功(3-9，15)。對(duì)于IL-10基因治療實(shí)體器官移植的改良的方法的需求是存在的，該改良方法導(dǎo)致了足以降低慢性移植排斥發(fā)生可能的持續(xù)局部IL-10表達(dá)。
發(fā)明內(nèi)容一方面，本發(fā)明涉及到使用帶有編碼諸如IL-10的免疫調(diào)節(jié)多肽的核酸序列的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)待移植實(shí)體器官細(xì)胞，上述核酸序列的表達(dá)降低了宿主免疫系統(tǒng)對(duì)移植器官的排斥的可能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除了rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)待移植實(shí)體器官外，本發(fā)明還包含使用免疫調(diào)節(jié)劑抑制急性排斥。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫抑制劑在大約移植的時(shí)間給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫抑制劑在移植前給予。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫抑制劑是從包括但不限于IL-10和FK506的組中選出的一種或多種試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一旦rAAV介導(dǎo)的諸如IL-10的免疫調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)開始，用免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)行的治療將被縮減或停止。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及到在將該器官移植到受治者前，通過給予編碼IL-10的rAAV載體到分離的實(shí)體器官來提高實(shí)體器官移植的效率的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，IL-10在給予rAAV載體后在分離的器官中的至少某些細(xì)胞中表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，IL-10的表達(dá)引起了Thl樣到Th2樣免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。在各個(gè)實(shí)施方案中，待轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)體器官是心臟、腎臟、肝臟、胰島、肺和腸。具體實(shí)施方式在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在將分離的實(shí)體器官移植到受治者前，用編碼諸如IL-10的免疫調(diào)節(jié)多肽的rAAV載體處理該器官。編碼免疫調(diào)節(jié)多肽的核酸序列在本文中是指轉(zhuǎn)基因。在所述的移植器官的細(xì)胞和組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可能會(huì)延遲或/和預(yù)防移植排斥?？赡苡糜诒景l(fā)明方法中的合適免疫調(diào)節(jié)多肽包括但不限于IL-IO、IL-1抑制劑、CD-40配體抑制劑、TGF-P、GITR和FOXP3.盡管AAV載體提供了伴隨輕微組織炎癥的持久轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但是從AAV載體而來的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的開始通常延遲1-2周，與此相對(duì)照，腺病毒載體僅延遲幾個(gè)小時(shí)。因此，可能可以同免疫調(diào)節(jié)劑組合的AAV載體的使用在大約同移植同時(shí)的時(shí)間給予，并且，在另一個(gè)實(shí)施方案中，一旦轉(zhuǎn)基因表達(dá)開始，免疫調(diào)節(jié)劑就可以縮減或停止。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一旦轉(zhuǎn)基因以足以預(yù)防移植排斥的水平表達(dá)，免疫調(diào)節(jié)劑的給予就停止。如本文中所用，免疫調(diào)節(jié)劑是指任何諸如小分子、多肽或蛋白質(zhì)等不被基因治療作為轉(zhuǎn)基因傳遞的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于IL-10蛋白，F(xiàn)K506、環(huán)孢霉素、雷帕霉素、咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯、環(huán)磷酰胺、來氟米特和糖皮質(zhì)激素。在本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案中，可以單獨(dú)使用一種免疫調(diào)節(jié)劑，也可依次或同時(shí)組合使用兩種或更多種免疫調(diào)節(jié)劑。根據(jù)本發(fā)明的方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床實(shí)驗(yàn)容易地確定給予免疫調(diào)節(jié)劑到接受實(shí)體器官移植的受治者的最佳時(shí)間。相類似地，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能做實(shí)驗(yàn)來確定已知免疫調(diào)節(jié)劑中哪一種在預(yù)防急性排斥方面是最好的，直到rAAV介導(dǎo)的IL-10表達(dá)開始。移植器官中長(zhǎng)期的IL-10表達(dá)是否預(yù)防了慢性排斥可通過測(cè)定在心臟移植中所見到同種異體抗體形成、白細(xì)胞浸潤(rùn)和積累的移植動(dòng)脈病來部分測(cè)定。實(shí)施例1RAAV-IL-10在同源心臟和腎臟移植中的應(yīng)用下述實(shí)驗(yàn)被進(jìn)行來確定AAV2-大鼠IL-10(rIL-10)在同源心臟和腎臟移植中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，使用AAV空載體處理的大鼠作為對(duì)照。這個(gè)實(shí)驗(yàn)用于建立體外轉(zhuǎn)導(dǎo)后移植器官中轉(zhuǎn)基因rIL-10表達(dá)的開始時(shí)間、水平和持續(xù)時(shí)間。*順行性(anterograde)/分離的心臟或腎臟在冷環(huán)境中用lX10g載體灌注20分鐘。*器官移植回自體同源宿主。*轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在第7、14、28、56和180天時(shí)進(jìn)行測(cè)定。1、DNAFISH用于轉(zhuǎn)基因rlL-10DNA的測(cè)定，IF用于rlL-10蛋白在移植器官中表達(dá)的測(cè)定。2、rIL-10在包括心臟、肺、肝臟、腎臟、脾臟和PBMC等的各種組織中的生物分布通過PCR和RT-PCR進(jìn)行測(cè)量。3、系統(tǒng)的rIL-10生產(chǎn)通過血清rIL-10水平的ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例2RAAV-IL-10在心和腎同種異體移植中的應(yīng)用下述實(shí)驗(yàn)被進(jìn)行來確定AAV2-rIL-10轉(zhuǎn)導(dǎo)在延長(zhǎng)同種異體移植存活期上的效率。接受用AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的移植器官的大鼠的組如表3中所示。在某些實(shí)驗(yàn)中，rIL-10蛋白作為免疫調(diào)節(jié)劑給予來度過轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)之間的時(shí)間間隔。因?yàn)橄到y(tǒng)給予IL-10己經(jīng)被證明會(huì)惡化小鼠的心臟同種異體移植排斥，因此，在其它實(shí)驗(yàn)中，傳統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)劑FK506替代IL-10被給予，直到AAV介導(dǎo)的IL-10表達(dá)建立。對(duì)照實(shí)驗(yàn)包括非處理組；用AAV2空載體處理組；和用不含AAV載體的傳統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)劑處理組。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>進(jìn)行下述的分析。測(cè)定移植器官存活期。測(cè)定屬于單核因子的Thl細(xì)胞因子的表達(dá)來確定它們?cè)谟肁AV2-rlL10轉(zhuǎn)導(dǎo)的移植器官中是否被下調(diào)。假如需要，可以使用細(xì)胞因子蛋白質(zhì)芯片來篩選更廣的被IL-10調(diào)控的細(xì)胞因子譜。最后，測(cè)定作為同種異體特異T細(xì)胞的反應(yīng)性的同種異體反應(yīng)性抗體和白細(xì)胞浸潤(rùn)的水平。參考文獻(xiàn)ZhangY-Claire,etal.Adeno-AssociatedVirus-MediatedIL-10GenTherapyInhibitsDiabetesRecurrenceinSyngenicIsletcellTransplantationofNODMiceDiabetes,52:708-716,2003GoudyKevin,etal.Adeno-Associatedvirusvector-mediatedIL-10genedeliverypreventstype1diabetesNODmice:PNAS98:13913-13918,2001SenLuyi,etal.Efficiency,efficacy,andadverseeffectsofadenovirusvs.Liposome-mediatedgenetherapyincardiacallografts.AmJPhysiolHeartCircPhysiol281:1433-1441,2001FischerStefanetal:InVivoTranstrachealAdenovirus-MediatedTransferofHumanInterleukin-10GenetoDonorLungsAmelioratesIschemia-ReperflisionInjuryandImprovesEarlyPosttransplantGraftFunctionintheRatHumanGeneTherapy12:1513-1526，2001KennethE.Drazan,etal:TransductionofHepaticAllograftAchievesLocalLevelsofViralIL-10whichSuppressAlloreactivityinVitroJournalofSurgicalResearch,59,219-223,1995ShojiFetal:Airway-directedgenetransferofinterleukin-10usingrecombinantSendaiviruseffectivelypreventspost-transplantfibrousobliterationinmiceGeneTherapy10:213-218,2003FuShuang,etal:SuppressionofAutoimmuneDiabetesbyViralIL-10GeneTransferProlongsNon-VascularizedCardiacAllograftSurvivalAmericanJournalofTransplantation3:552-567,2003YangZangong,etal:SuppressionofAutoimmuneDiabetesbyViralIL-10GeneTransferTheJournalofImmunology168:6479-6485,2002FischerStefan,etal.:Interleukin10genetransfectionofdonorlungsamelioratesposttransplantcelldeathbyaswitchfromcellularnecrosistoapoptosis:JournalofThoracicandCardiovascularSurgeryOctober:1174-1180,2003HongYooSun,etal:LocalizedImmunosuppressionintheCardiacAllograftInducedbyaNewLiposome-mediatedIL-10GenetherapyJHeartLungTransplant21:11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