專利名稱：防治魔芋軟腐病的生物制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治魔芋細菌性軟腐病的生物制劑及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
魔芋富含葡甘露聚糖，是自然界僅有的幾種含天然葡甘露聚糖的植物之一，也是唯一分布廣、適應(yīng)性強、可大量提取葡甘露聚糖的植物。是一種極具開發(fā)潛力的醫(yī)療保健食品和工業(yè)原料。隨著魔芋產(chǎn)品的不斷開發(fā)和農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，魔芋已成為我國中西部山區(qū)的一種主要經(jīng)濟作物，是農(nóng)民脫貧致富、振興地方經(jīng)濟的有效途徑之一。據(jù)不完全統(tǒng)計，2005年，云南省種植面積達15萬畝，全國的種植面積約為80萬畝。無論是國外或國內(nèi)，由細菌引起的軟腐病是魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的第一限制因素。魔芋往往前幾年發(fā)展勢頭較好，但隨著種植年限的延長，栽培面積的擴大，軟腐病流行周期越來越短，病情逐年加重，局部地區(qū)軟腐病的發(fā)生造成絕收，嚴重地阻礙魔芋產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，最后導(dǎo)致種植面積銳減。嚴重挫傷了農(nóng)民種植魔芋的積極性，阻礙了地方經(jīng)濟的發(fā)展。
魔芋細菌性軟腐病是一種對魔芋生產(chǎn)具有毀滅性危害的世界性植物病害，經(jīng)我們研究證實主要由胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種Erwinia carotovora subsp.carotovora引起，其次是菊歐文氏菌E.chrysanthermi。據(jù)不完全統(tǒng)計，僅在云南省，魔芋軟腐病每年綜合發(fā)病率達35％以上，魔芋損失率達21.5％，每畝造成經(jīng)濟損失774元，全縣每年由于軟腐病危害而造成的魔芋損失達1200多萬元。對于魔芋細菌性軟腐病，目前國內(nèi)主要以輪作等農(nóng)業(yè)措施和大劑量的化學(xué)農(nóng)藥等防治措施，但在我國人多地少的情況下，采用輪作來防治魔芋細菌性軟腐病的可行性越來越低；化學(xué)防治不僅成本高、防效差，而且污染環(huán)境，影響品質(zhì)，并且一些病原細菌對生產(chǎn)上常用的農(nóng)用鏈霉素表現(xiàn)出抗藥性，使防治效果更差。另外，由于化學(xué)農(nóng)藥使用及農(nóng)藥殘留量超過國際標準，影響了其對外出口的增長。
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對健康和環(huán)境問題日益關(guān)注，發(fā)展高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效的魔芋生產(chǎn)已成為提高芋區(qū)農(nóng)民經(jīng)濟收入的關(guān)鍵問題，特別是近幾年有機魔芋或無公害魔芋生產(chǎn)已成為魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主導(dǎo)方向，在防治病害方面更需要農(nóng)業(yè)和生物防治等不造成農(nóng)殘和環(huán)境污染的防病措施。因此，篩選開發(fā)出一種高效、無毒、安全無殘留、使用簡便的防治魔芋細菌性軟腐病的生物制劑，對減輕病害危害、提高品質(zhì)、增強魔芋農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性、保障魔芋產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，使農(nóng)民增產(chǎn)、增收具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有方法的不足，提供了一種高效、無毒、安全、無殘留、使用簡便的防治魔芋細菌性軟腐病的生物制劑。
本發(fā)明采用的細菌是解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關(guān)村；保藏日期2005年12月05日；保藏登記入冊的編號CGMCCNo.1553。
本發(fā)明的生產(chǎn)菌株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3，分離自云南富源魔芋根際土壤，經(jīng)形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀、常規(guī)生理生化和Biolog全自動鑒定系統(tǒng)測定，該生防細菌為解淀粉芽孢桿菌的一個新菌株(Bacillus amyloliquefaciens)C3。該菌株具有以下特征(1)菌落不規(guī)則圓形，菌落邊緣裂頁狀，菌落初期粘稠，后期起皺，乳白色，不透明，菌體在液體中不易分散，不產(chǎn)色素，產(chǎn)芽孢；在顯微鏡下觀察菌體直桿狀，大小0.7～0.8×2.0～2.4μm；(2)該菌株定殖能力強、抑菌能力強、能促進魔芋生長，具有殺菌、防病、增產(chǎn)的作用。該菌株可在魔芋的根際和體內(nèi)定殖。對該作物上的主要病原菌Erwinia carotovora有顯著抑制作用，抑菌圈直徑平均為14.0-20.0mm。(3)具有以下生理生化特征革蘭氏染色陽性、能利用糖原、吐溫40、N-乙酰-D-葡糖胺、核糖醇、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、L-巖藻糖、D-半乳糖、龍膽二糖、meso-肌醇、乳酮糖、D甘露醇、D-阿洛酮糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、甲基丙酮酸、乙酸、檸檬酸、甲酸、D-半乳糖酸內(nèi)、D-葡糖酸、A-羥基乙酸、Y-羥基乙酸、衣康酸、a-丁酮酸、a-酮基戊酸、丙酸、琥珀酸、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰-甘氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、DL-肉堿、Y-氨基丁酸、尿苷酸、次黃苷、尿苷、胸苷、苯乙胺、丁二胺、2-氨基乙醇、葡糖-6-磷酸；不能利用環(huán)化糊精、糊精、N-乙酰D半乳糖、纖維二糖、D果糖、a-D-葡萄糖、a-D-乳糖、麥芽糖、蔗糖、D-海藻糖、木糖醇、內(nèi)二酸、L-脯氨酸、D-絲氨酸、甘油。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3菌株的試管培養(yǎng)，搖床擴大培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)制備為生物制劑，將其運用于魔芋上，測定其對魔芋細菌性軟腐病的防治效果和產(chǎn)量。
本發(fā)明生防菌株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3的培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)1、試管種培養(yǎng)試管斜面培養(yǎng)基配方為牛肉浸0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，瓊脂1.7-2.0％，pH6.8-7.0。
將Bacillus amyloliquefaciens C3移到試管斜面培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)1-2天，獲得試管種。
2、液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉2.0％，淀粉1.0％，葡萄糖0.30％，KH2PO40.1％，蛋白胨0.2％(NH4)2SO40.05％，MgSO4.7H2O 0.03％，CaCO30.1％，花生油0.1％，消泡劑0.01％，pH 7.5-8.0。
將試管種接種到500ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝200ml，于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)14小時，轉(zhuǎn)速為150-200rpm，所得培養(yǎng)液即可為制劑，也可轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中進行發(fā)酵生產(chǎn)，獲得液體制劑。
液體發(fā)酵條件罐溫發(fā)酵罐的罐溫均控制在25-32℃，通過插入培養(yǎng)基的溫度計測量，以夾層內(nèi)通入冷卻水或熱水的方法進行調(diào)節(jié)。
罐壓發(fā)酵罐的罐壓控制在0.5/平方厘米，通過無菌空氣入口和廢氣排放口進行調(diào)節(jié)。
攪拌發(fā)酵罐的攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘。
抽樣檢查和培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)每2小時自取樣管取樣1次，測定pH，并涂片以結(jié)晶紫染色鏡檢菌體形態(tài)、有無雜菌的污染，觀察菌體是否產(chǎn)芽孢等，待鏡檢菌體芽孢數(shù)占整個菌體的5％以上時，減少通風(fēng)量和降低培養(yǎng)溫度至22℃左右，其它條件不變，繼續(xù)培養(yǎng)和抽樣檢查，待鏡檢菌體芽孢數(shù)占整個菌體的85％以上時，停止培養(yǎng)和放罐，發(fā)酵罐放罐時鏡檢計數(shù)，并用培養(yǎng)基平板方法進行活菌的計數(shù)。
培養(yǎng)周期發(fā)酵罐的培養(yǎng)周期約為36-48小時。
液體發(fā)酵制劑經(jīng)平板計數(shù)測定含菌量，含菌量達180億CFU/ml，供田間防治病害用。
3、固體發(fā)酵培養(yǎng)首先進行細菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)(同上)。然后經(jīng)加入填充劑、板框過濾、打漿、干燥、粉碎，制成可濕性粉劑。具體過程如下具體加入填充劑將發(fā)酵液壓入貯罐，根據(jù)以下計算公式加入硅藻土(輕質(zhì)碳酸鈣)作為填充劑，加入后攪拌30分鐘。
填充劑硅藻土(輕質(zhì)碳酸鈣)的加入量(公斤)＝〖發(fā)酵液菌數(shù)(億/毫升)×放罐體積(升)×收率〗/成品菌數(shù)-發(fā)酵液中的殘存物(公斤)。
板框過濾用2公斤/平方厘米的壓力，將物料由貯罐壓入板框，通過7號濾布過濾，壓力應(yīng)隨時調(diào)節(jié)，使濾液中的含菌量不超過0.2億/毫升。
打漿將濾餅卸入打漿罐，按加入碳酸鈣量的8％加入濃乳100號，或按3％加入SDS，加入適量的濾液均勻攪拌30分鐘。
混勻?qū)⒋驖{后的含菌硅藻土粉碎，陰干，再按5倍體積稀釋，攪拌混勻。
干燥在溫度60℃以下的烘干房內(nèi)通風(fēng)干燥至含水量5％-8％。
粉碎粉碎時出料溫度不能超過60℃，以防止菌體失活。
成品質(zhì)量指標測定含菌量、含水量、懸俘率、細度的測定均參照國家企業(yè)標準(Q/KWL02-2003)進行，含菌量10億/克，其余各項指標均符合標準。
本發(fā)明生物制劑防治軟腐病田間藥效試驗和增產(chǎn)試驗1、制備生物制劑按前述Bacillus amyloliquefaciens C3培養(yǎng)方法制備試驗用制劑。
2、生防菌C3液體制劑對魔芋軟腐病田間藥效和增產(chǎn)試驗2.1供試藥劑及處理A、生防菌C3液體制劑250倍稀釋液采用澆根法，每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次用藥，共施藥2次，間隔7天。
B、生防菌C3液體制劑500倍稀釋液采用澆根法，每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次用藥，共施藥2次，間隔7天。
C、生防菌C3液體制劑1000倍稀釋液采用澆根法，每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次用藥，共施藥2次，間隔7天。
D、對照殺菌劑百菌清500倍倍稀釋液采用澆根法，每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次用藥，共施藥2次，間隔7天。
E、空白對照施用清水，采用澆根法，每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次施用，共施用2次，間隔7天。
2.2、試驗方法供試作物為花魔芋(富源縣地方品種)，防治對象為魔芋細菌性軟腐病，試驗地點為云南省富源縣竹園鎮(zhèn)。
試驗設(shè)5個處理，3次重復(fù)，共15個小區(qū)。小區(qū)面積不小于20平方米，隨機排列。
四周設(shè)保護行，收獲時每小區(qū)測產(chǎn)。
2.3、調(diào)查方法在魔芋發(fā)病后期，對試驗小區(qū)進行病害調(diào)查.根據(jù)魔芋軟腐病地上部分癥狀特點及病情發(fā)展趨勢，我們將病斑分為環(huán)繞型和縱向型，前者病斑環(huán)繞葉柄，病情發(fā)展快.會很快引起復(fù)葉倒伏，危害性大；后者病斑只在葉柄一側(cè)，多沿維管束縱向擴展，后期向橫向擴展后導(dǎo)致整個葉柄腐爛。
魔芋軟腐病的分級標準(病情分為5級)0級無癥狀；1級葉柄一側(cè)有2cm以下小型水浸狀病斑，或病斑長占葉柄總長度的1/10以下，同側(cè)葉片輕度黃化；2級葉柄一側(cè)有2cm以上病斑，或病斑長占葉柄總長度的1/10-5/10，同側(cè)葉片黃化；3級病斑呈環(huán)繞型，或縱向型病斑長度占葉柄總長的5/10以上，葉片大部分黃化或部分枯死；4級全葉枯黃或倒伏腐爛。
若整個復(fù)葉從頂端開始黃化，葉柄與塊莖連接處有軟腐癥狀，為塊莖發(fā)病，病情歸入3級。
3、生防菌C3可濕性粉劑對魔芋軟腐病田間藥效和增產(chǎn)試驗1、供試藥劑及處理A、生防菌C3可濕性粉劑250倍稀釋液采用澆根法，每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次用藥，共施藥2次，間隔7天。
B、生防菌C3可濕性粉劑500倍稀釋液采用澆根法，每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次用藥，共施藥2次，間隔7天。
C、生防菌C3可濕性粉劑1000倍稀釋液采用澆根法，每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次用藥，共施藥2次，間隔7天。
D、對照殺菌劑百菌清500倍倍稀釋液采用澆根法，每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次用藥，共施藥2次，間隔7天。
E、空白對照施用清水，采用澆根法，每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次施用，共施用2次，間隔7天。
2、試驗方法供試作物為花魔芋(富源縣地方品種)，防治對象為魔芋細菌性軟腐病，試驗地點為云南省富源縣竹園鎮(zhèn)。
試驗設(shè)5個處理，3次重復(fù)，共15個小區(qū)。小區(qū)面積不小于20平方米，隨機排列。
四周設(shè)保護行，收獲時每小區(qū)測產(chǎn)。
3、調(diào)查方法在魔芋發(fā)病后期，對試驗小區(qū)進行病害調(diào)查.根據(jù)魔芋軟腐病地上部分癥狀特點及病情發(fā)展趨勢，我們將病斑分為環(huán)繞型和縱向型，前者病斑環(huán)繞葉柄，病情發(fā)展快.會很快引起復(fù)葉倒伏，危害性大；后者病斑只在葉柄一側(cè)，多沿維管束縱向擴展，后期向橫向擴展后導(dǎo)致整個葉柄腐爛。
魔芋軟腐病的分級標準(病情分為5級)0級無癥狀；1級葉柄一側(cè)有2cm以下小型水浸狀病斑，或病斑長占葉柄總長度的1/10以下，同側(cè)葉片輕度黃化；2級葉柄一側(cè)有2cm以上病斑，或病斑長占葉柄總長度的1/10--5/10，同側(cè)葉片黃化；3級病斑呈環(huán)繞型，或縱向型病斑長度占葉柄總長的5/10以上，葉片大部分黃化或部分枯死；4級全葉枯黃或倒伏腐爛。
若整個復(fù)葉從頂端開始黃化，葉柄與塊莖連接處有軟腐癥狀，為塊莖發(fā)病，病情歸入3級。
4、試驗結(jié)果4.1生防菌C3液體制劑對魔芋軟腐病田間藥效和增產(chǎn)試驗表1解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3液體制劑對魔芋軟腐病田間防治效果
表2解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3液體制劑對魔芋的增產(chǎn)效果
從表1和表2可以看出生防菌C3液體制劑對魔芋軟腐病防治和增產(chǎn)效果明顯，其中稀釋250倍處理防治和增產(chǎn)效果最好，防治效果達到77.9％.灌根500倍和1000倍的處理，對魔芋軟腐病控制效果分別為53.3％和46.7％。與稀釋500倍百菌清相比，施用生防菌C3液體制劑的各個處理(250倍，500倍，1000倍，)的病株率分別比其低1.64％，2.01％，1.55％，病情指數(shù)比百菌清低8.71、3.94、2.67，防治效果比其高45.00％，20.40％，13.80％，顯示了該生防制劑具有較好的防效；同時與稀釋500倍百菌清相比，施用生防菌C3的各個處理(250倍，500倍，1000倍，)的增產(chǎn)率分別比其高33.34％，25.00％，25.00％，顯示該產(chǎn)品具有一定的促生、增產(chǎn)作用，故該產(chǎn)品具備了生產(chǎn)上大量推廣的基本條件。
本次施藥方法采用澆根法，研究中發(fā)現(xiàn)，灌根處理的魔芋植株，病原菌從莖基部侵入的機率顯著降低，但仍發(fā)現(xiàn)一些田間地上部分腐爛植株，主要從葉片等地上部侵入。因此，今后在施藥方法上應(yīng)用澆根法和葉面噴霧法結(jié)合使用，達到有效控制魔芋軟腐病的目的。
4.2生防菌C3可濕性粉劑對魔芋軟腐病田間藥效和增產(chǎn)試驗表3解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3可濕性粉劑對魔芋軟腐病田間防治效果
表4解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3可濕性粉劑對魔芋的增產(chǎn)效果
從表3和表4可以看出生防菌C3可濕性粉劑對魔芋軟腐病防治和增產(chǎn)效果明顯，其中稀釋250倍處理防治和增產(chǎn)效果最好，防治效果達到79.3％。灌根500倍和1000倍的處理，對魔芋軟腐病控制效果分別為54.3％和52.8％。與稀釋500倍百菌清相比，施用生防菌C3可濕性粉劑的各個處理(250倍，500倍，1000倍，)的病株率分別比其低2.03％，1.91％，1.66％，病情指數(shù)比百菌清低8.96、4.14、3.84，防治效果比其高46.40％，21.40％，19.90％，顯示了該生防制劑具有較好的防效；同時與稀釋500倍百菌清相比，施用生防菌C3的各個處理(250倍，500倍，1000倍，)的增產(chǎn)率分別比其高35.43％，28.49％，23.07％，顯示該產(chǎn)品具有一定的促生、增產(chǎn)作用，故該產(chǎn)品具備了生產(chǎn)上大量推廣的基本條件。
總體結(jié)果表明，本發(fā)明的生物制劑(不管是液體制劑還是可濕性粉劑)防治魔芋細菌性軟腐病效果顯著，且兼有促生、增產(chǎn)的效果。
本發(fā)明的制劑主要防治對象為魔芋軟腐病。本制劑可通過浸種、灌根、噴霧等方式施用。本發(fā)明的制劑已在云南省曲靖市富源縣進行了田間小區(qū)防效試驗，證明該生防制劑防效顯著、穩(wěn)定，可以有效地解決長期困擾芋農(nóng)的魔芋細菌性軟腐病的防治難題。對魔芋細菌性軟腐病防效達46.7-79.30％。
具體實施例方式本生防制劑可以與其他的殺細菌農(nóng)藥、植物生長調(diào)節(jié)劑混合使用，但必須保證所混藥劑對本發(fā)明采用的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3無副作用。
本發(fā)明的細菌生防制劑一般在作物播種或病害始發(fā)期施用。方法是播種前，采用發(fā)酵制劑與種球浸(拌)種后，涼干施入土壤中，或在病害始發(fā)期將本制劑通過灌根施入魔芋莖基部或噴霧方法，稀釋300-500倍使用。對魔芋細菌性軟腐病發(fā)生嚴重地區(qū)可在魔芋生長過程中追施2-3次。
本發(fā)明具有對魔芋細菌性軟腐病防、治效果明顯，適用于魔芋整個生育期，具有成本低、使用簡便、有效期較長等特點。
下面用實施例來進一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例一將解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3轉(zhuǎn)到試管斜面培養(yǎng)基上，試管斜面培養(yǎng)基配方為牛肉浸0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，瓊脂1.7％，pH7.0。
在28℃恒溫培養(yǎng)2天，獲得試管種。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉2.0％，淀粉1.0％，葡萄糖0.30％，KH2PO40.1％，蛋白胨0.2％(NH4)2SO40.05％，MgSO4.7H2O 0.03％，CaCO30.1％，花生油0.1％，消泡劑0.01％，pH 7.5；將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為牛肉浸0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，瓊脂1.7。于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)14小時，轉(zhuǎn)速為150rpm，所得培養(yǎng)液即為本發(fā)明生物制劑。
實施例二首先獲得試管種(同實施例一)，將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為牛肉浸0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，瓊脂2.0％。于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)14小時，轉(zhuǎn)速為200rpm，所得培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中進行發(fā)酵生產(chǎn)，獲得液體制劑。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉2.0％，淀粉1.0％，葡萄糖0.30％，KH2PO40.1％，蛋白胨0.2％(NH4)2SO40.05％，MgSO4.7H2O 0.03％，CaCO30.1％，花生油0.1％，消泡劑0.01％，pH 8.0。
液體發(fā)酵條件罐溫發(fā)酵罐的罐溫均控制在25℃，通過插入培養(yǎng)基的溫度計測量，以夾層內(nèi)通入冷卻水或熱水的方法進行調(diào)節(jié)。
罐壓發(fā)酵罐的罐壓控制在0.5/平方厘米，通過無菌空氣入口和廢氣排放口進行調(diào)節(jié)。
攪拌發(fā)酵罐的攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘。
抽樣檢查和培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)每2小時自取樣管取樣1次，測定pH，并涂片以結(jié)晶紫染色鏡檢菌體形態(tài)、有無雜菌的污染，觀察菌體是否產(chǎn)芽孢等，待鏡檢菌體芽孢數(shù)占整個菌體的5％以上時，減少通風(fēng)量和降低培養(yǎng)溫度至22℃左右，其它條件不變，繼續(xù)培養(yǎng)和抽樣檢查，待鏡檢菌體芽孢數(shù)占整個菌體的85％以上時，停止培養(yǎng)和放罐，發(fā)酵罐放罐時鏡檢計數(shù)，并用培養(yǎng)基平板方法進行活菌的計數(shù)。
培養(yǎng)周期發(fā)酵罐的培養(yǎng)周期約為36小時。
液體發(fā)酵制劑經(jīng)平板計數(shù)測定含菌量，含菌量達180億CFU/ml，供田間防治病害用。
即得本發(fā)明生物制劑。
實施例三首先進行細菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)(同實施例二)。然后經(jīng)加入填充劑、板框過濾、打漿、干燥、粉碎，制成可濕性粉劑。具體過程如下具體加入填充劑將發(fā)酵液壓入貯罐，按放罐體積的10％加入填充劑硅藻土(輕質(zhì)碳酸鈣)，加入后攪拌30分鐘。
板框過濾用2公斤/平方厘米的壓力，將物料由貯罐壓入板框，通過7號濾布過濾，壓力應(yīng)隨時調(diào)節(jié)，使濾液中的含菌量不超過0.2億/毫升。
打漿將濾餅卸入打漿罐，按加入碳酸鈣量的8％加入濃乳100號，或按3％加入SDS，加入2％的濾液均勻攪拌30分鐘。
混勻?qū)⒋驖{后的含菌硅藻土粉碎，陰干，再按5倍體積稀釋，攪拌混勻。
干燥在溫度60℃以下的烘干房內(nèi)通風(fēng)干燥至含水量8％。
粉碎粉碎時出料溫度不能超過60℃，以防止菌體失活。
成品質(zhì)量指標測定含菌量、含水量、懸俘率、細度的測定均參照國家企業(yè)標準(Q/KWL02-2003)進行，含菌量10億/克，其余各項指標均符合標準。
即得本發(fā)明生物制劑。
權(quán)利要求
1.一種防治魔芋細菌性軟腐病病害的生物制劑，其特征在于該制劑的生產(chǎn)菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3，保藏號CGMCCNo.1553。
2.權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述菌株是經(jīng)過常規(guī)的液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的，所述的液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下(1)液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方黃豆粉2.0％，淀粉1.0％，葡萄糖0.30％，KH2PO40.1％，蛋白胨0.2％(NH4)2SO40.05％，MgSO4·7H2O 0.03％，CaCO30.1％，花生油0.1％，消泡劑0.01％，含水量為96.11％，pH 7.5-8.0；(2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方牛肉浸0.3％，酵母浸膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，瓊脂1.7-2.0％，含水量為96.1％-96.4％，pH 7.5-8.0。
3.權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C3菌株在防治魔芋細菌性軟腐病病害中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治魔芋細菌性軟腐病的生物制劑及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。其生產(chǎn)菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)C
文檔編號A01P3/00GK1792167SQ20051004875
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者姬廣海, 李成云, 葉敏, 吳亞鵬 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)