專利名稱：尖頂羊肚菌菌株的篩選及菌種制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及羊肚菌的菌株篩選及菌種制備方法。
背景技術(shù)：
羊肚菌Morchella是世界著名的名貴野生食用菌，尖頂羊肚菌Morchellaconica是云南產(chǎn)羊肚菌的主要種類之一。羊肚菌的人工栽培小試偶有成功的報(bào)道，但栽培試驗(yàn)的重復(fù)性差，至今尚不能進(jìn)行商業(yè)化栽培，市場(chǎng)上的羊肚菌均來自野生。近年來野生羊肚菌由于過度采集和采集方式不科學(xué)以及無相應(yīng)的技術(shù)措施，造成自然產(chǎn)量大幅下降。研究表明，在產(chǎn)區(qū)自然環(huán)境條件下，采用人工菌種和配套的技術(shù)措施，是解決羊肚菌供需矛盾的最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一。
在羊肚菌保護(hù)擴(kuò)繁技術(shù)中，優(yōu)良菌種的獲得是關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。羊肚菌菌株的獲得通常是利用子實(shí)體或孢子進(jìn)行分離、純化，直接應(yīng)用于羊肚菌的栽培或菌絲體生產(chǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)的不足在于羊肚菌菌種不能用出菇的方法進(jìn)行菌種鑒定，只能根據(jù)菌絲形態(tài)及分離物來初步確定是否為羊肚菌純培養(yǎng)物；生產(chǎn)的菌種一般用固體菌種。目前在國內(nèi)采用液體菌種進(jìn)行羊肚菌資源的保護(hù)擴(kuò)繁應(yīng)用不廣泛。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，利用云南原產(chǎn)地尖頂羊肚菌子實(shí)體篩選出優(yōu)良菌株，采用生物技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，制備羊肚菌液體及固體優(yōu)良菌種，為羊肚菌野生資源保護(hù)擴(kuò)繁提供優(yōu)良菌種。
本發(fā)明采用的真菌是尖頂羊肚菌Morchella conica M0503；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國.北京.中關(guān)村；保藏日期2005年08月11日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCC NO.1437。
尖頂羊肚菌子實(shí)體較小，高5～8cm。子囊果近圓柱形，尖頂，淺褐色，表面凹下形成長(zhǎng)形凹坑，縱向排列。菌柄白色，有不規(guī)則縱溝。子囊近圓柱形，子囊孢子8個(gè)，單行排列。菌絲生長(zhǎng)初期緊貼培養(yǎng)基，無色，有光澤，隨著菌落的增大，有叉狀或樹枝狀分支，后期產(chǎn)生菌核及淺褐色色素。
本發(fā)明的技術(shù)方案
①采集野生羊肚菌子實(shí)體；②組織分離或孢子分離；③純化菌株及菌株鑒定；④生物學(xué)特性比較及生產(chǎn)性狀比較；⑤確定優(yōu)良菌株；⑥菌種生產(chǎn)及菌種應(yīng)用；經(jīng)過反復(fù)篩選，獲得菌絲體產(chǎn)量高、抗污染的羊肚菌液體菌種專用菌株M0503。
本發(fā)明真菌Morchella conica培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)菌種分離純化培養(yǎng)基2％羊肚菌下腳料、0.001％VB1、2％葡萄糖、2％瓊脂；羊肚菌菌株分離及鑒定方法1、將羊肚菌子實(shí)體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于18-24℃下培養(yǎng)5-10天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得羊肚菌分離試管種。
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18-24℃下培養(yǎng)5-7天，獲得羊肚菌純化試管種。
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定，通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的尖頂羊肚菌(Morchella.conica)Identities＝488/522(93％)，Gaps＝9/522(1％)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為尖頂羊肚菌菌絲體。
本發(fā)明羊肚菌菌種的制備方法分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種。
液體菌種制備方法液體培養(yǎng)基配方為5-10％麩皮、0.5-1％黃豆粉、0.5-1％麥芽糖、1-3％玉米粉，余下為水，pH自然。
1、將羊肚菌的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24℃下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種。
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160r/min，培養(yǎng)時(shí)間5-7天。
3、將搖瓶菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1∶0.8v/(v·min)；攪拌轉(zhuǎn)速為120-160r/min；接種量為5-10％；罐壓0.04Mpa；pH為6.0；溫度為20-26℃；通氣培養(yǎng)72-96小時(shí)，獲得羊肚菌液體菌種。
固體菌種制備方法固體培養(yǎng)基配方為木屑75-90％、麩皮5-20％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生長(zhǎng)地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。
1、將羊肚菌的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，于18-24℃下培養(yǎng)5-7天，獲得試管菌種。
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-26℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120-160r/min，培養(yǎng)時(shí)間5-7天。
3、采用前述固體培養(yǎng)基配方。將培養(yǎng)料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口瓶中，壓緊封口后在120℃滅菌60分鐘，接入液體菌種，于20-26℃培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長(zhǎng)滿。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一1、將尖頂羊肚菌子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于18℃下培養(yǎng)10天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得羊肚菌分離試管種。
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于18℃下培養(yǎng)7天，獲得羊肚菌純化試管種。
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定，通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的尖頂羊肚菌(Morchella.conica)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為尖頂羊肚菌菌絲體。
4、將Morchella conica M0503的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，18℃下培養(yǎng)7天，獲得試管種。
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為5％麩皮、0.5％黃豆粉、0.5％麥芽糖、1％玉米粉，余下為水，pH自然。于20℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120rpm，培養(yǎng)時(shí)間7天，獲得一級(jí)液體菌種。
將一級(jí)液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1∶0.8v/(v·min)；攪拌轉(zhuǎn)速為120r/min；接種量為5％；罐壓0.04Mpa；pH為6.0；溫度為22℃；通氣培養(yǎng)96小時(shí)，獲得羊肚菌液體菌種。
實(shí)施例二菌種制備的步驟與實(shí)施例一相同。
1、將尖頂羊肚菌子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于22℃下培養(yǎng)6天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得羊肚菌分離試管種。
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于22℃下培養(yǎng)6天，獲得羊肚菌純化試管種。
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定，通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的尖頂羊肚菌(Morchella.conica)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為尖頂羊肚菌菌絲體。
4、將Morchella conica 0503的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，22℃下培養(yǎng)6天，獲得試管種。
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為6％麩皮、0.6％黃豆粉、0.6％麥芽糖、1.2％玉米粉，余下為水，pH自然。于22℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)時(shí)間6天，獲得一級(jí)液體菌種。
將一級(jí)液體菌種接種到25L自動(dòng)發(fā)酵生產(chǎn)線的發(fā)酵罐中，通氣量為1∶0.8v/(v·min)；攪拌轉(zhuǎn)速為140r/min；接種量為8％；罐壓0.04Mpa；pH為6.0；溫度為24℃；通氣培養(yǎng)84小時(shí)，獲得羊肚菌液體菌種。
實(shí)施例三1、將尖頂羊肚菌子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24℃下培養(yǎng)5天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得羊肚菌分離試管種。
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24℃下培養(yǎng)5天，獲得羊肚菌純化試管種。
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定，通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的尖頂羊肚菌(Morchella.conica)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為尖頂羊肚菌菌絲體。
4、將Morchella conica 0503的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24℃下培養(yǎng)5天，獲得試管種。
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為10％麩皮、0.5％黃豆粉、0.5％麥芽糖、1％玉米粉，余下為水，pH自然。于26℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)時(shí)間5天，獲得一級(jí)液體菌種。
將一級(jí)液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為木屑75％、麩皮20％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生長(zhǎng)地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。將木屑、麩皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml，120℃滅菌60分鐘后，接種后置于26℃培養(yǎng)15天，獲得羊肚菌固體菌種。
實(shí)施例四1、將尖頂羊肚菌子實(shí)體組織塊接種到上述菌種分離純化培養(yǎng)基斜面上，于24℃下培養(yǎng)5天，對(duì)分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，獲得羊肚菌分離試管種。
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上，于24℃下培養(yǎng)5天，獲得羊肚菌純化試管種。
3、采用供試子實(shí)體與對(duì)應(yīng)菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及ITS序列測(cè)定，通過Blast對(duì)比樣品的ITS序列與GENBANK中的尖頂羊肚菌(Morchella.conica)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為尖頂羊肚菌菌絲體。
4、將Morchella conica 0503的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，24℃下培養(yǎng)5天，獲得試管種。
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為8％麩皮、0.5％黃豆粉、1％麥芽糖、1％玉米粉，余下為水，pH自然。于26℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)時(shí)間5天，獲得一級(jí)液體菌種。
將一級(jí)液體菌種接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為木屑90％、麩皮5％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生長(zhǎng)地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。將木屑、麩皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml，120℃滅菌60分鐘后，接種后置于20℃培養(yǎng)20天，獲得羊肚菌固體菌種。
權(quán)利要求
1.一種尖頂羊肚菌菌株，其特征在于所述菌株為(Morchella conica)M0503，該菌株的保藏號(hào)為CGMCC NO.1437。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖頂羊肚菌菌株的制備方法，所述菌株是經(jīng)過常規(guī)的液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的，其特征在于所述液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下(1)液體培養(yǎng)基配方為5-10％麩皮、0.5-1％黃豆粉、0.5-1％麥芽糖、1-3％玉米粉，余下為水，pH自然；(2)固體培養(yǎng)基配方為木屑75-90％、麩皮5-20％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生長(zhǎng)地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種尖頂羊肚菌菌株的篩選及菌種制備方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的菌株Morchella conica M0503已于2005年08月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.1437。利用該菌株制備的液體及固體優(yōu)良菌種，應(yīng)用于羊肚菌野生資源原產(chǎn)地的保護(hù)擴(kuò)繁，提高羊肚菌的自然產(chǎn)量及品質(zhì)，有著顯著的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01G1/04GK1793315SQ200510048679
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者桂明英, 劉蓓, 朱萍, 郭永紅 申請(qǐng)人:云南菌苑科技有限公司, 云南省供銷合作社科學(xué)研究所