專利名稱：一種培育茯苓的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物的培育方法，尤其是涉及一種培育茯苓的方法。
背景技術(shù)：
茯苓為一種多年生腐生真菌，屬于真菌門，具有藥用價值，是一味常用大宗中藥。野生茯苓通常在海拔500米以上，生長在地下20厘米左右的腐朽的松樹根或松樹段上。茯苓的生長發(fā)育可分為兩個階段，即菌絲生長階段和菌核形成階段，菌絲生長階段主要是菌絲從松木中吸收水分和營養(yǎng)，繁殖大量的營養(yǎng)菌，當(dāng)菌絲越積越多時就成為菌核，到形成菌核階段時栽培上稱為結(jié)苓階段。目前人工培育茯苓的方法主要有干段木栽培和松樹根栽培，段木栽培法以松木為栽培料，選擇直徑12厘米以上不成材的松樹砍倒，在農(nóng)歷12月份砍下松樹，去樹杈，削去形成層的外皮，露出木質(zhì)部，削皮留筋，鋸成60～80厘米長的木段，堆碼后干燥，約40天后，無松脂分泌，木心干燥后即可接種。松木段下窖的時間在春季3-4月份，下窖選擇晴天，每窖下松木段15-20公斤。接種方法目前有三種較普遍采用，一是菌絲引種，將栽培菌種內(nèi)長滿菌絲的松木塊取出，順段木形成的“V”縫，一塊接一塊平鋪在上面，再撒上木屑等料種，然后將一根段木削皮處向下壓在松木塊上，使其呈“品”字形。二是老段木引種，選黃白色、筋皮下有明顯菌絲且有小茯苓又有特殊香氣的段木作種引。三是鮮茯苓引種，選1-2代種苓，種苓皮色紫紅，肉色白，漿氣足，質(zhì)結(jié)實(shí)，個重2-3公斤的鮮苓作種引。將種苓切成小塊或小片放于段木之間，每一窖需500克左右鮮苓。接好種后，立即覆土，厚7-10厘米，使窖頂呈龜背形，以利排水。用松樹段木栽培茯苓要消耗大量木材。松樹根栽培法為首先挖開根周圍的土，露出松根，將側(cè)根刮開皮槽，曝曬數(shù)天，曬干后即可接種。于5-8月間在松根開槽處接放菌種，用樹葉將其蓋好，覆土壓實(shí)即可。接后每10天檢查1次，發(fā)現(xiàn)病蟲害和白蟻要及時防治。9～12月茯苓膨大生長期要及時培土。第二年4-6月可采收，此方法雖能節(jié)約大量材耗但產(chǎn)量低，不能滿足需求。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可取代現(xiàn)有茯苓栽培種植用材，不需采伐樹木，易于推廣，產(chǎn)量高的培育茯苓的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案在于，培育茯苓的方法采用菌種繁殖法。首先選取優(yōu)良苓種，其標(biāo)準(zhǔn)為品質(zhì)好，無病蟲害，個體較大，近球形，質(zhì)地堅，皮紅，肉白，漿汁多，氣味濃郁的茯苓菌核；然后進(jìn)行母種保存和培養(yǎng)；最后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行原種和栽培種的制作和擴(kuò)繁。其中母種的培養(yǎng)包括母種的分離和在培養(yǎng)基上的接種培養(yǎng)，原種的制作是將母種接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，栽培種的制作是在培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)菌培養(yǎng)，具體工藝如下1、母種的分離和培養(yǎng)母種分離方法為用無菌水將種苓沖洗數(shù)次，再用紗布揩干，最后用75％酒精擦洗種苓外皮，并用0.1％升汞擦洗干凈后，進(jìn)行紫外線滅菌；在無菌條件下，用無菌刀將種苓剖開，用酒精火焰滅菌后的接種鏟從種苓較深部位取出黃豆大小的苓肉，接入試管斜面上；配制母種培養(yǎng)基，其組分為馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水1000毫升，另加0.5克酵母粉，0.5克蛋白胨，PH值為5.5-6.5；母種的培養(yǎng)過程為在溫度28-32℃，培養(yǎng)2-3天，長出菌絲后，認(rèn)定無雜菌即可繼續(xù)培養(yǎng)至菌絲長滿斜面。
2、原種的制作原種制作中用的培養(yǎng)基其配方為松木屑76％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；其接種培養(yǎng)過程為在無菌條件下，按常規(guī)將母種接入上述配制好的培養(yǎng)基瓶中，置28-32℃溫室中培養(yǎng)，經(jīng)25-30天，菌絲長滿瓶即為原種。
3、栽培種的制作栽培種制作中所需的培養(yǎng)基配方為松木片(2厘米×10厘米×0.3厘米)65％，松木屑10％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，尿素0.2％；其發(fā)菌培養(yǎng)過程為將上述配料按常規(guī)配制后裝入15厘米×18厘米×0.005絲米的聚乙烯塑料袋中，經(jīng)滅菌接種后置28-32℃下培養(yǎng)，經(jīng)25-30天，當(dāng)菌絲長滿并深入至木片內(nèi)后即可。
本發(fā)明提供的培育茯苓的方法，能培育出茯苓菌絲和茯苓菌核；由于在母種、原種、栽培種的培養(yǎng)過程中，其培養(yǎng)基由人工配制而成，不需要天然松木，因而不用采伐樹木，可用于大批量生產(chǎn)，種植成本低。經(jīng)試驗(yàn)，生產(chǎn)出的茯苓其外形與現(xiàn)有商品茯苓一致，顯微構(gòu)造基本一致，多糖提取率相近，完全可替代商品茯苓入藥。這種茯苓種植用材代用品的開發(fā)，既能保證中醫(yī)臨床用藥，又有效地保護(hù)了森林資源，不失為中醫(yī)藥行業(yè)生產(chǎn)類似產(chǎn)品的一種行之有效的方法。
具體實(shí)施例方式
菌種培養(yǎng)的具體工藝如下1、選取優(yōu)良苓種其標(biāo)準(zhǔn)為品質(zhì)好，無病蟲害，個體較大，近球形，質(zhì)地堅，皮紅，肉白，漿汁多，氣味濃郁的茯苓菌核。
2、母種的分離和培養(yǎng)母種分離方法為用無菌水將種苓沖洗數(shù)次，再用紗布揩干，最后用75％酒精擦洗種苓外皮，并用0.1％升汞擦洗干凈后，進(jìn)行紫外線滅菌；在無菌條件下，用無菌刀將種苓剖開，用酒精火焰滅菌后的接種鏟從種苓較深部位取出黃豆大小的苓肉，接入試管斜面上；母種培養(yǎng)基的配方為馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水1000毫升，另加0.5克酵母粉，0.5克蛋白胨，PH值為5.5-6.5；母種的培養(yǎng)過程為在溫度28-32℃，培養(yǎng)2-3天，長出菌絲后，認(rèn)定無雜菌即可繼續(xù)培養(yǎng)至菌絲長滿斜面。
3、原種的制作原種制作中用的培養(yǎng)基的配方為松木屑76％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；其接種培養(yǎng)過程為在無菌條件下，按常規(guī)將母種接入上述配制好的培養(yǎng)基瓶中，置28-32℃溫室中培養(yǎng)，經(jīng)25-30天，菌絲長滿瓶即為原種。
4、栽培種的制作栽培種制作中所需的培養(yǎng)基配方為松木片(2厘米×10厘米×0.3厘米)65％，松木屑10％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，尿素0.2％；其發(fā)菌培養(yǎng)過程為將上述配料按常規(guī)配制后裝入15厘米×18厘米×0.005絲米的聚乙烯塑料袋中，經(jīng)滅菌接種后置28-32℃下培養(yǎng)，經(jīng)25-30天，當(dāng)菌絲長滿并深入至木片內(nèi)后即可。
茯苓菌種在松枝、木屑瓶內(nèi)菌絲生長情況及試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下2003年5月22日，將直徑1厘米左右小松枝截短至15厘米，木屑分別浸泡在營養(yǎng)液中，待浸透后撈出，分別放入瓶中，高壓消毒后，5月30日接種茯苓菌種，接種兩天后菌絲開始生長，6月20日已形成菌索，8月9日已形成6×3厘米不等的白色塊狀物，其質(zhì)地致密，表面呈粉狀。菌絲生長情況如下表
表1茯苓菌絲在瓶內(nèi)生長情況表
顯微比較研究商品茯苓(購于成都市藥材公司)，由茯苓成熟菌核分離得到茯苓菌絲為母種(瓊脂、馬鈴薯等)，由茯苓母種擴(kuò)繁得到的茯苓菌絲為原種(木屑等)，由茯苓原種擴(kuò)大培養(yǎng)得到茯苓菌絲為茯苓栽培種(即新配方生長的茯苓菌絲、菌核)。
1、商品茯苓的顯微特征商品茯苓的粉末用水裝片，在顯微鏡下可觀察到無色不規(guī)則的顆粒狀團(tuán)塊和分支狀團(tuán)塊；用5％的NaOH溶液裝片，可見團(tuán)塊溶化，露出菌絲，菌絲細(xì)長，稍彎曲，有分支，呈無色或淡棕色。
2、茯苓菌絲母種的顯微特征茯苓菌絲母種的粉末，用水裝片和5％的NaOH溶液裝片觀察到菌絲，菌絲細(xì)長，稍彎曲，有分支，呈無色或淡棕色。
3、茯苓原種菌絲的顯微特征茯苓菌絲原種的粉末，用水裝片時，可見到分支狀團(tuán)塊，也可見到少量的菌絲；用5％的NaOH溶液裝片時，只能見到菌絲，菌絲細(xì)長，稍彎曲，有分支，呈無色或淡棕色。
4、新配方生長的茯苓菌絲、菌核的顯微特征同上方法裝片只能見到菌絲，菌絲細(xì)長，稍彎曲，有分支，呈無色或淡棕色。與商品茯苓的顯微特征基本一致。
提取工藝的確定茯苓水溶性多糖提取工藝的確定選用復(fù)合方法提取茯苓水溶性多糖。即將茯苓粉末(過40目篩)適量，用乙酸乙酯、丙酮于索氏提取器分別提取4小時，藥渣加入催化酶酶解，于60-70℃浸泡40分鐘，再依次用5倍量、3倍量、2倍量的沸水提取1小時。合并水提液，濾過，濾液濃縮至1/10，用Severge法除蛋白。上清液加入三倍量的乙醇沉淀多糖，冷藏12小時，離心，收集沉淀，低溫干燥，即得。
茯苓堿溶性多糖提取工藝的確定茯苓堿溶性多糖含量較高，提取方法相對簡單，所得提取率較穩(wěn)定。即將水提后的藥渣用稀NaOH溶液提取，堿提液離心，所得上清液以10％的醋酸中和，3倍量乙醇沉淀，再提純即得。綜合考慮了生產(chǎn)可行性及經(jīng)濟(jì)性，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)后確定稀NaOH溶液用量為5倍量，提取2次，每次4小時。
茯苓多糖的提取定量實(shí)驗(yàn)取低溫烘干后的商品茯苓、母種、原種，新配方生長的茯苓菌絲、菌核適量精密稱定，按上述方法提取多糖，結(jié)果如下表表2茯苓多糖提取率
茯苓多糖含量測定采用苯酚—硫酸法，對商品茯苓、本發(fā)明新配方生長的茯苓菌絲和菌核、茯苓菌絲母種、茯苓菌絲原種進(jìn)行茯苓多糖含量測定。測定結(jié)果如下表3茯苓多糖含量測定結(jié)果
由上可見，該發(fā)明新配方生長的茯苓菌絲、菌核與商品茯苓比較，多糖提取率相近，可代替商品茯苓入藥，并且該發(fā)明新配方生長的茯苓菌絲、菌核的培育成本低，可以大批量生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種培育茯苓的方法，其特征在于該方法包括選取優(yōu)良苓種、母種保存和培養(yǎng)、在此基礎(chǔ)上進(jìn)行原種和栽培種的制作和擴(kuò)繁，具體工藝如下(1)母種的培養(yǎng)母種分離方法為用無菌水將種苓沖洗數(shù)次，再用紗布揩干，最后用75％酒精擦洗種苓外皮，并用0.1％升汞擦洗干凈后，進(jìn)行紫外線滅菌；在無菌條件下，用無菌刀將種苓剖開，用酒精火焰滅菌后的接種鏟從種苓較深部位取出黃豆大小的苓肉，接入試管斜面上；母種培養(yǎng)基的配制為馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水1000毫升，0.5克酵母粉，0.5克蛋白胨，pH5.5-6.5；母種培養(yǎng)過程為在溫度28-32℃，培養(yǎng)2-3天，長出菌絲后，認(rèn)定無雜菌即可繼續(xù)培養(yǎng)至菌絲長滿斜面；(2)原種的制作原種培養(yǎng)基的配制為松木屑76％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；原種接種培養(yǎng)過程為在無菌條件下，按常規(guī)將母種接入上述配制好的培養(yǎng)基瓶中，置28-32℃溫室中培養(yǎng)，經(jīng)25-30天，菌絲長滿瓶即為原種；(3)栽培種的制作栽培種培養(yǎng)基的配方為形狀為2厘米×10厘米×0.3厘米的松木片65％，松木屑10％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，尿素0.2％；栽培種發(fā)菌培養(yǎng)過程為將上述配料按常規(guī)配制后裝入15厘米×18厘米×0.005絲米的聚乙烯塑料袋中，經(jīng)滅菌接種后置28-32℃下培養(yǎng)，經(jīng)25-30天，當(dāng)菌絲長滿并深入至木片內(nèi)后即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育茯苓的方法，屬于微生物培育方法的技術(shù)領(lǐng)域，采用菌種繁殖法，選取優(yōu)良苓種，進(jìn)行母種保存和培養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行原種和栽培種的制作和擴(kuò)繁；母種的培養(yǎng)包括母種的分離和在培養(yǎng)基上的接種培養(yǎng)，原種的制作為將母種接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，栽培種的制作為在培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)菌培養(yǎng)；本發(fā)明提供的培育茯苓的方法，可以培育出茯苓菌絲和菌核，在母種、原種、栽培種的培養(yǎng)過程中，其培養(yǎng)基由人工配制而成，不需要天然松木，因而不用采伐樹木，可用于大批量生產(chǎn)，種植成本低。
文檔編號A01G1/00GK1732761SQ20051002136
公開日2006年2月15日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者何俊蓉, 李萍, 徐利遠(yuǎn) 申請人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所