專利名稱：一種防治植物細(xì)菌病害的生物制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治植物細(xì)菌病害的生物制劑及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物細(xì)菌性病害是僅次于真菌性病害，危害大、損失重、分布較廣的世界性植物病害之一，尤其是細(xì)菌性青枯病是一種世界性的土傳病害，危害番茄、辣椒、煙草、馬鈴薯等400余種經(jīng)濟作物，目前尚無農(nóng)藥可防治。對于多種作物的軟腐病、水稻白葉枯病、紅掌細(xì)菌性疫病等，目前國內(nèi)市場上只有大劑量的化學(xué)農(nóng)藥可以防治，但一些病原細(xì)菌對生產(chǎn)上常用的農(nóng)用鏈霉素表現(xiàn)抗藥性，因此，農(nóng)用鏈霉素的防病效果較差，另外，由于化學(xué)農(nóng)藥使用和殘留量超過國際標(biāo)準(zhǔn)，出口農(nóng)產(chǎn)品紛紛遭到拒絕和退貨。
隨著我國人民生活水平的提高，蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品的數(shù)量問題已經(jīng)不是大家考慮的主要問題，而其質(zhì)量特別是農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)引起了幾乎全體國民的憂患意識。目前對于細(xì)菌性害國內(nèi)外主要采取的保守控制措施為進行種薯(種子)消毒，拔除病株，加強檢疫和采用衛(wèi)生潔園等農(nóng)業(yè)措施，控制進一步傳播。因此，研究開發(fā)高效、無毒、安全無殘留、使用簡便的防治植物細(xì)菌病害的生物制劑，已經(jīng)是我國農(nóng)業(yè)發(fā)展中迫在眉睫的問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，通過抗生素溶桿菌(Lysobacterantibioticus)13-1的研究，開發(fā)出一種高效、無毒、安全無殘留、使用簡便的防治植物細(xì)菌病害的生物制劑。
本發(fā)明采用的細(xì)菌是抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticu5)13-1，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關(guān)村；保藏日期2005年9月13日；保藏登記入冊的編號CGMCC NO.1456。
抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticus)13-1，系本發(fā)明人于2002年發(fā)現(xiàn)的一個國內(nèi)外未見報道，可用于植物細(xì)菌病害生物防治的新菌株。
本發(fā)明的生產(chǎn)菌株13-1，分離自昆明市郊土壤，經(jīng)形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀、常規(guī)生理生化和Biolog全自動鑒定系統(tǒng)測定，以及16s rRNA和16S-23S rRNAITS序列分析，該生防細(xì)菌為抗生素溶桿菌Lysobacter antibioticus的一個新菌株。16s rRNA序列(Genebank No.DQ188260)分析與抗生素溶桿菌Lysobacter antibioticusDSM 2044菌株(Genebank No.AB019582)同源性達(dá)99％，但該菌株的16S-23S rRNA ITS序列(GenebankNo.DQ188259)分析在Genebank中未發(fā)現(xiàn)與溶桿菌屬內(nèi)不同種相似的同源性序列。該菌株具有以下特征(1)菌落圓形，不透明稀液狀，培養(yǎng)初期為暗黃色，后期轉(zhuǎn)為棕褐色菌落，菌體長桿狀；(2)該菌株抑菌譜廣、抑菌能力和作物根際定殖能力強，該菌株可在馬鈴薯、魔芋等作物的根際定殖。對重要作物的病原細(xì)菌Ralstonia Solanacearum，Pseudomonas syringae，Erwinia carotovora，Xanthomonas屬中的X.oryzae pv.oryzae，X.axonopodis pv.diffenbachiae等均有顯著抑制作用，抑菌圈直徑平均為11.0-20.0mm，同時還對真菌(鐮孢菌Fusarium spp.等)亦具有抑菌作用。(3)具有以下生理生化特征革蘭氏染色陰性，氧化酶和過氧化氫酶陽性，硝酸鹽不還原，明膠液化、淀粉和吐溫80不水解，吲哚和精氨酸雙水解酶和脲酶陰性。能利用葡萄糖產(chǎn)酸，可水解酪蛋白；常規(guī)和Biolog生理生化特征能利用N-乙酰-D-半乳糖、N-乙酰-D-葡糖胺、D-甘露糖、α-D-葡萄糖、D-海藻糖、檸檬酸、3-羥基乙酸、α-丁酮酸、α-酮戊二酸、丙酸、琥珀酸、溴琥珀酸、丙氨酰胺、L-脯氨酸、L-蘇氨酸；不能利用L-絲氨酸、L-組氨酸、阿拉伯糖、麥芽糖、密二糖、組氨酸、纖維二糖等。該菌株在糖原、麥芽糖、α-D-葡萄糖、檸檬酸鹽等項目上與Lysobacter antibioticus DSM 2044菌株具有差異。(4)本發(fā)明的生物制劑對多種重要細(xì)菌病害具有顯著的防治效果，如Ralstonia solanacearum引起的植物青枯病，Erwinia carotovora supsp.carotovora等引起的作物(如魔芋、馬蹄蓮等)細(xì)菌性軟腐病，Xanthomonas屬病原細(xì)菌引起的作物細(xì)菌性病害如水稻白葉枯病等。同時具備了工業(yè)化生產(chǎn)的基本性狀。
本發(fā)明按常規(guī)方法制備。即將抗生素溶桿菌13-1菌株，通過液體或固體培養(yǎng)，獲得包括細(xì)菌菌體培養(yǎng)物，通過液體發(fā)酵生產(chǎn)，加入潤濕劑、展著劑，或與吸附載體按一定比例混合后，經(jīng)過濾、濃縮、粉碎和涼干，制備成液劑或可濕性粉劑。
本發(fā)明的生物制劑的具體制備過程如下一.液體發(fā)酵制劑生產(chǎn)1.供試菌株抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticus)13-1菌株，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省植物病理重點實驗室提供。
2.試管種培養(yǎng)(以下均為重量百分比)將13-1菌株接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為1000毫升NA培養(yǎng)基蛋白胨5g，蔗糖10克，酵母粉1g，牛肉浸膏3g，瓊脂17-20g(培養(yǎng)基用)，蒸餾水(補足1000ml)。22-26℃下培養(yǎng)24-48h，獲得試管種。
3.菌種搖床擴大培養(yǎng)將斜面種子接種茄瓶斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基，配方前述試管種培養(yǎng)2相同。24-28℃下培養(yǎng)24-48h，獲得茄瓶種子，供發(fā)酵生產(chǎn)用。
4.中試液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程如下試管菌種→茄瓶種子→孢子懸浮液→發(fā)酵罐(無菌空氣，培養(yǎng)液)→發(fā)酵液→填充罐(輕質(zhì)碳酸鈣)→板框壓濾機(棄去濾液)→濾餅→調(diào)漿→加入潤濕劑、展著劑等→60℃烘干→粉碎→菌粉→質(zhì)量檢查。
具體發(fā)酵生產(chǎn)過程如下(1)茄瓶斜面種子液的制備將已培養(yǎng)好的茄瓶斜面上的菌苔，用滅菌水洗下，制備細(xì)菌懸浮液。
(2).接種采用茄瓶種子，將種子懸浮液通過接種口，利用壓差接入發(fā)酵罐，操作嚴(yán)格，避免污染。升壓時罐壓不能超過1.5/平方厘米。
(3)液體發(fā)酵生產(chǎn)a.發(fā)酵罐培養(yǎng)基黃豆粉2％，葡萄糖0.3％，蛋白胨0.2％，淀粉3％、碳酸鈣0.2％，魚粉0.5％，花生油0.1％，硫酸銨0.05％，硫酸鎂0.03％，磷酸二氫鉀0.03％，磷酸氫二鉀0.03％，消泡劑0.01％，NaOH 600g。滅菌前pH8.5。
b.滅菌鍋爐的總蒸汽壓應(yīng)在4-5公斤/平方厘米，以保證各管道的蒸汽壓力。管道、空氣過濾器、發(fā)酵罐及培養(yǎng)基的滅菌，均按生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)進行。
C.發(fā)酵條件的控制罐溫發(fā)酵罐的罐溫均控制在29±1℃，通過插入培養(yǎng)基的溫度計測量，以夾層內(nèi)通入冷卻水或熱水的方法進行調(diào)節(jié)。
罐壓發(fā)酵罐的罐壓控制在0.06MPa，通過無菌空氣入口和廢氣排放口進行調(diào)節(jié)。
攪拌發(fā)酵罐的攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘。
通風(fēng)量8至15m3/h(根據(jù)細(xì)菌不同培養(yǎng)時期產(chǎn)氣泡量進行調(diào)節(jié))。
抽樣檢查每2小時自取樣管取樣1次，測定pH，并涂片以結(jié)晶紫染色鏡檢菌體形態(tài)、有無雜菌的污染等，發(fā)酵罐放罐時鏡檢計數(shù)，并用培養(yǎng)基平板方法進行活菌的計數(shù)。
培養(yǎng)周期發(fā)酵罐的培養(yǎng)周期約為36-48小時，當(dāng)培養(yǎng)基中的菌數(shù)不再增加時即可停止培養(yǎng)，立即放罐。
液體發(fā)酵制劑經(jīng)平板計數(shù)測定含菌量，含菌量達(dá)180億CFU/ml，供田間防治病害用。
2.固體生物制劑的生產(chǎn)首先進行細(xì)菌的液體發(fā)酵生產(chǎn)(同前述一相同)。然后經(jīng)加入填充劑、板框過濾、打漿、干燥、粉碎，制成可濕性粉劑，供實驗用。具體過程如下具體加入填充劑將發(fā)酵液壓入貯罐，根據(jù)以下計算公式加入硅藻土(輕質(zhì)碳酸鈣)作為填充劑，加入后攪拌30分鐘。
填充劑硅藻土(輕質(zhì)碳酸鈣)的加入量(公斤)＝〖發(fā)酵液菌數(shù)(億/毫升)×放罐體積(升)×收率〗/成品菌數(shù)—發(fā)酵液中的殘存物(公斤)。
板框過濾用2公斤/平方厘米的壓力，將物料由貯罐壓入板框，通過7號濾布過濾，壓力應(yīng)隨時調(diào)節(jié)，使濾液中的含菌量不超過0.2億/毫升。
打漿將濾餅卸入打漿罐，按加入碳酸鈣量的8％加入濃乳100號，或按3％加入SDS，加入適量的濾液均勻攪拌30分鐘。
干燥在溫度60℃以下的烘干房內(nèi)通風(fēng)干燥至含水量5％-8％。
粉碎粉碎時出料溫度不能超過60℃，以防止菌體失活。
成品質(zhì)量指標(biāo)測定含菌量、含水量、懸浮率、細(xì)度的測定均參照國家企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(Q/KWL02-2003)進行，含菌量18億/克，其余各項指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施例方式本發(fā)明的制劑主要防治對象為作物青枯病、魔芋軟腐病、水稻白葉枯病等。本制劑可通過常規(guī)的灌根、浸種、噴霧等方式施用。本發(fā)明的制劑已在云南昆明市郊、曲靖富源和紅河州蒙自等地的溫室和田間小區(qū)防效試驗，證明該生防制劑防效顯著、穩(wěn)定，可以有效地解決長期困擾青枯病、細(xì)菌性軟腐病等防治難題。對青枯病的防效達(dá)94.3％～95.0％，細(xì)菌性軟腐病防效達(dá)67.64-79.00％，對水稻白葉枯病的防治效果達(dá)到69.41-78.33％。
本生防制劑可以與其他的殺細(xì)菌農(nóng)藥、植物生長調(diào)節(jié)劑混合使用，但必須保證所混藥劑對本發(fā)明采用的抗生素溶桿菌無副作用。
本發(fā)明的細(xì)菌生防制劑一般在作物播種或病害始發(fā)期施用。方法是播種前，采用發(fā)酵制劑與種球或種子浸(拌)種后，涼干施入土壤中，或在病害始發(fā)期將本制劑通過灌根施入作物根際周圍或噴霧施用。對植物細(xì)菌病害發(fā)生嚴(yán)重地區(qū)可在作物生長過程中追施1至2次。
本發(fā)明的生防制劑具有明顯穩(wěn)定的防治效果，綜合性狀好，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
下面用實施例來進一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實例一生防制劑對馬鈴薯青枯病的藥效試驗1、試驗用藥劑按液體發(fā)酵方法制備；以未接種的培養(yǎng)基3600轉(zhuǎn)離心20分鐘后過濾作為對照。
2、青枯病菌菌懸液體制備青枯病菌菌株Tb23由中國農(nóng)科院植物保護研究所何禮遠(yuǎn)教授提供。采用TTC培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)48-72h，接種是將病菌從固體培養(yǎng)基上用無菌水洗下制成菌懸液，在搖床上搖勻。接種時的濃度用分光光度計測定吸收值，OD(600nm)＝0.1，濃度相當(dāng)于108CFU/ml。
3、試驗方法和結(jié)果分析分為預(yù)防和治療兩組試驗。預(yù)防控病試驗方案為將馬鈴薯于2003年3月1日播種。每處理3次重復(fù)。在馬鈴薯成株期用發(fā)酵液體菌劑，生長期使用時，對水100、250、500倍灌根處理(2003.4.25)，3d后再用青枯病菌懸液灌根(2003.4.29)。并設(shè)清水對照處理和病原菌(Tb23)處理。觀察馬鈴薯的發(fā)病情況，在用病原菌灌根后14d、25d分別進行調(diào)查，記載各個處理的病情指數(shù)、發(fā)病率，并計算防效。治療控病試驗方法同上。不同之處是先用病原菌對馬鈴薯進行灌根處理，3d后再用生防菌劑的菌懸液進行灌根。在用病原菌灌根后14d、25d分別進行調(diào)查。所設(shè)對照、觀察記載方法同上，每處理重復(fù)三次。
發(fā)病率％＝發(fā)病株(葉)數(shù)×100/調(diào)查總株(葉)數(shù)病情指數(shù)＝∑(各級病株(葉)數(shù)×該病級值)×100/調(diào)查總株(葉)數(shù)×最高級值防效％＝(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))×100/對照病情指數(shù)馬鈴薯青枯病病情調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)(病情分為6級)0級沒有癥狀；I級1-2個葉片萎蔫；II級3片至全株1/3葉片萎蔫；III級全株1/2葉片萎蔫；IV級全株3/4葉片萎蔫；V級整株植物萎蔫或死亡。
4、試驗結(jié)果結(jié)果表明液體發(fā)酵制劑對馬鈴薯青枯病具有較好的防治效果，其中預(yù)防控病效果好于治療控病效果(表1)。預(yù)防控制試驗中14d測定的結(jié)果可知，病原菌處理的病株率達(dá)100％，病情指數(shù)最高為70.0；液體菌劑處理的病情指數(shù)為0，發(fā)病率為0；25d調(diào)查結(jié)果顯示液體菌劑處理的馬鈴薯病情指數(shù)在5.0左右，植株發(fā)病率為14.3％至25.0％，防效為94.3％-95.0％。治療控病試驗中，14d測定的結(jié)果可知，對照的病情指數(shù)為70.0，發(fā)病率為100％，液體菌劑處理的平均病情指數(shù)18.3，最低病情指數(shù)為10.0，平均防效為73.8％，最高防效為85.7％。25d調(diào)查結(jié)果顯示，液體菌劑處理平均防效仍達(dá)到52.5％，最高防效為62.5％。
表1液體發(fā)酵制劑對馬鈴薯青枯病的防治效果
注同一欄中不同小寫英文字母表示差異顯著水平達(dá)0.05。
實例二生防制劑對魔芋軟腐病田間藥效試驗1、實驗地點及時間試驗地點富源縣竹園鎮(zhèn)新街村委會補陸村試驗時間2005年7月6日至2005年8月15日2.試驗材料及方法2.1、供試藥劑生防菌13-1可濕性粉劑(固體制劑)，對照殺菌劑為百菌清2.2、供試作物魔芋2.3、防治對象魔芋細(xì)菌性軟腐病2.4、試驗方法試驗設(shè)5個處理，3次重復(fù)，共15個小區(qū)。小區(qū)面積不小于60平方米，隨機排列。施藥方法采用澆根法。每株魔芋根部澆藥液50毫升，發(fā)病初期施第一次藥，共施藥2次，間隔7天。
2.5、調(diào)查方法在魔芋發(fā)病后期，對試驗小區(qū)進行病害調(diào)查.根據(jù)魔芋軟腐病地上部分癥狀特點及病情發(fā)展趨勢，我們將病斑分為環(huán)繞型和縱向型，前者病斑環(huán)繞葉柄，病情發(fā)展快.會很快引起復(fù)葉倒伏，危害性大；后者病斑只在葉柄一側(cè)，多沿維管束縱向擴展，后期向橫向擴展后導(dǎo)致整個葉柄腐爛。
魔芋軟腐病的分級標(biāo)準(zhǔn)(病情分為5級)
0級無癥狀；1級葉柄一側(cè)有2cm以下小型水浸狀病斑，或病斑長占葉柄總長度的1/10以下，同側(cè)葉片輕度黃化；2級葉柄一側(cè)有2cm以上病斑，或病斑長占葉柄總長度的1/10--5/10，同側(cè)葉片黃化；3級病斑呈環(huán)繞型，或縱向型病斑長度占葉柄總長的5/10以上，葉片大部分黃化或部分枯死；4級全葉枯黃或倒伏腐爛。
若整個復(fù)葉從頂端開始黃化，葉柄與塊莖連接處有軟腐癥狀，為塊莖發(fā)病，病情歸入3級。
3、實驗結(jié)果及分析從表2可以看出生防菌13-1可濕性粉劑對魔芋軟腐病防治效果明顯，其中稀釋250倍處理防治效果最好，達(dá)到79％.灌根500倍和1000倍的處理，對魔芋軟腐病控制效果分別為70.57％和67.64％。與稀釋500倍百菌清相比，施用生防菌13-1的各個處理(250倍，500倍，1000倍，)的病株率分別比其低1.64％，2.01％，1.55％，病情指數(shù)比百菌清低4.22、3.53、3.29，防治效果比其高52.75％，44.32％，41.39％，顯示了該生防制劑具有較好的防效，具備了生產(chǎn)上大量推廣的基本條件。
本次施藥方法采用澆根法。研究中發(fā)現(xiàn)，處理的魔芋植株，病原菌從莖基部侵入的機率顯著降低，但仍發(fā)現(xiàn)一些田間地上部分腐爛植株，主要從葉片等地上部位侵入。因此，今后在施藥方法上應(yīng)用澆根法和葉面噴霧法結(jié)合使用，達(dá)到有效控制魔芋軟腐病的目的。
表213-1可濕性粉劑對魔芋軟腐病田間防治效果
實施例三生防制劑對水稻白葉枯病的藥效試驗1、實驗材料與方法1.1、供試藥劑生防菌13-1液劑1.2、供試作物水稻1.3、防治對象水稻白葉枯病1.4.實驗地點云南省紅河州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所(蒙自)水稻實驗田，肥力中等，栽種感白葉枯病品種黃殼糯，小區(qū)為單行區(qū)，面積33平方米，每處理設(shè)3個重復(fù)，隨機排列，共9個小區(qū)，四周設(shè)保護行，按優(yōu)質(zhì)水稻栽培措施規(guī)范化管理。
1.5病原菌和生防菌劑的制備水稻白葉枯病菌株53的制備菌株在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36-48h(28℃-30℃)接種是將病菌從固體培養(yǎng)基上用無菌水洗下制成菌懸液，在搖床上搖勻。接種時的濃度用分光光度計測定吸收值，OD(600nm)＝0.5，濃度相當(dāng)于108-109CFU/ml。1.6接種方法先將生防菌13-1液劑噴霧接種在水稻葉片上(孕穗期)，3個重復(fù)，早、晚各噴一次并保溫、保濕2天。4天后，將配好的水稻白葉枯病菌53噴霧接種到噴過生防菌13-1的水稻上，早、晚各噴一次并保溫、保濕2天。同時設(shè)只噴白葉枯病菌株53的對照(CK)。21天后調(diào)查，調(diào)查病葉數(shù)，病葉級值、總?cè)~數(shù)，計算發(fā)病率、病情指數(shù)。調(diào)查記載和分級標(biāo)準(zhǔn)如表3表3噴霧接種的病級標(biāo)準(zhǔn)
發(fā)病率％＝發(fā)病株(葉)數(shù)×100/調(diào)查總株(葉)數(shù)病情指數(shù)＝∑(各級病株(葉)數(shù)×該病級值)×100/調(diào)查總株(葉)數(shù)×最高級值防效％＝(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))×100/對照病情指數(shù)。
2.試驗結(jié)果與分析試驗結(jié)果詳見表4，結(jié)果表明該發(fā)明制劑對水稻白葉枯病有良好的防治效果，施用藥劑三個重復(fù)病葉率和病情指數(shù)與對照相比，均有顯著的降低，對水稻白葉枯病的防治效果達(dá)到69.41-78.33％。顯示其潛在的應(yīng)用開發(fā)前景。
表4可濕性粉劑劑對水稻白葉枯病的防治效果
權(quán)利要求
1.一種防治多種植物細(xì)菌病害的生物制劑，由生產(chǎn)菌株和輔料按液體發(fā)酵或固體發(fā)酵生產(chǎn)方法制備，其特征在于該菌劑的生產(chǎn)菌株為抗生素溶桿菌(Lysobacterantibioticus)13-1，該菌株已于2005年9月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO1456。
2.權(quán)利要求1所述的生物制劑，其特征在于該生物制劑對多種作物細(xì)菌性害如馬鈴薯青枯病、魔芋軟腐病、水稻白葉枯病具有廣譜控病作用，可用于多種作物病害生物防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治植物細(xì)菌病害的生物制劑及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。該生物制劑按常規(guī)方法制備。其生產(chǎn)菌株為抗生素溶桿菌(Lysobacter antibioticus)13－1，已于2005年9月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No1456。發(fā)明的菌株具有以下顯著特點(1)菌落圓形，培養(yǎng)后期為棕褐色；(2)該菌株抑菌譜廣、抑菌能力強，能在馬鈴薯、魔芋等作物的根際定殖。本發(fā)明將該菌株，通過液體或固體培養(yǎng)，獲得包括細(xì)菌菌體培養(yǎng)物，通過液體發(fā)酵生產(chǎn)，加入潤濕劑、展著劑等制備成液劑，或與吸附載體按一定比例混合后，經(jīng)過濾、濃縮、粉碎和晾干，制備成可濕性粉劑。本發(fā)明對多種作物細(xì)菌病害具有明顯穩(wěn)定的防治效果，綜合性狀好，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A01P3/00GK1771810SQ200510011078
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者姬廣海, 張世光, 魏蘭芳, 何月秋, 李成云, 吳亞鵬 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)