專(zhuān)利名稱(chēng)：白桂木的離體繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物的離體繁殖方法，具體是涉及白桂木的離體繁殖方法。
背景技術(shù)：
1994年，我國(guó)先后公布了《中國(guó)生物多樣性行動(dòng)計(jì)劃》和《中國(guó)21世紀(jì)議程》，其中指出“中國(guó)動(dòng)植物種類(lèi)中已有15％-20％受到威脅，高于世界10％-15％的水平”。我國(guó)的植物資源十分豐富，約有3萬(wàn)多種，以此推算我國(guó)約有4500-6000種植物處于瀕?；蚴艿酵{。據(jù)報(bào)道，其中一些種群僅存一株或幾株。我國(guó)從80年代起開(kāi)始建立“全國(guó)珍稀瀕危植物種質(zhì)基因資源庫(kù)及數(shù)據(jù)庫(kù)”，91年公布了《中國(guó)植物紅皮書(shū)》(第一冊(cè))。對(duì)瀕危珍稀植物保護(hù)與保存主要有遷地保存(植物園)、就地保存(自然保護(hù)區(qū))和離體保存等幾種，其中，離體保存中的組織培養(yǎng)(in vitro culture)方法是近年發(fā)展起來(lái)的保護(hù)方法之一，特別對(duì)熱帶地區(qū)植物種質(zhì)保存具有重要意義，是物種保存的重要手段之一。如國(guó)際遺傳委員會(huì)(IBPGR)在英國(guó)皇家植物園已開(kāi)始了對(duì)東南亞重要材樹(shù)種龍腦香科植物的離體保存研究，該園還利用微繁殖對(duì)蘭類(lèi)(orchids)及蕨類(lèi)(ferns)植物開(kāi)展了離體保存實(shí)踐。
白桂木，又名糖桂木、狗囊。學(xué)名Artocarpus hypargyreus Hance，?？?Moraceae)，桂木屬(Artocarpus)常綠喬木，高可達(dá)十余米。葉革質(zhì)，互生，橢圓形或倒卵狀長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)7-22cm，寬3-8.5cm，頂端漸尖或短漸尖，基部楔形，全緣，但嫩葉常為羽狀淺裂，腹面無(wú)毛而有光澤，背面密被灰白色短絨毛，側(cè)脈7-9對(duì)和網(wǎng)脈均在背面凸起；葉柄長(zhǎng)1-2.2cm，有短毛?；ㄐ騿蝹€(gè)腋生，雌雄同株雄花序倒卵形或棒狀，長(zhǎng)1.5-2cm，橙黃色，外被褐色短柔毛。雌花序園頭狀。聚花果近球形，直徑3-4cm，黃色，干時(shí)褐色，有短毛，表面有不明顯宿存的乳狀凸起，萼片近軸部分分離，結(jié)果時(shí)約12片；果柄長(zhǎng)3.5-6.5cm，有短毛?；ㄆ谙募?；果期5-7月。主要分布于廣東、香港、海南、廣西、云南、湖南、江西、福建等省區(qū)。白桂木為喜光、喜濕樹(shù)種，散生于我國(guó)南方各省受帶季風(fēng)影響的低海拔至中海拔丘陵或山谷疏林中。
果味酸甜可食或用于調(diào)味的配料或糖漬，種子民間作為果仁食用；木材堅(jiān)硬，紋理通直，可供建筑家具等用材。(《廣東植物志》，1987年版，第一卷)。
?？浦参锓N子為頑拗型種子，通常認(rèn)為該類(lèi)種子與正常種子比，含水量高，不能進(jìn)行干燥處理，在日常濕、溫條件下干燥也會(huì)很快喪失生命力，其種子含水量低于一定的含水量(安全臨界含水量)時(shí)，種子將失去發(fā)芽力，這種種子需要在潮濕的環(huán)境保存。我們的實(shí)驗(yàn)表明，白桂木的種子發(fā)芽率低，經(jīng)日曬干燥后基本不發(fā)芽，這與頑拗型種子的特性是相符的。白桂木為喜光、喜濕樹(shù)種，在幼苗階段還需一定的蔭蔽條件。根據(jù)對(duì)生長(zhǎng)于東莞市白桂木孤立木(本實(shí)驗(yàn)采種母株，該樹(shù)為村邊風(fēng)水樹(shù))和對(duì)散生于次生林中的或在風(fēng)水林中的白桂木(成株)的考察，孤立木四周不見(jiàn)有白桂木小苗，而次生林中的成年白桂木周邊則有少量的不同年齡的白桂木分布。白桂木的這一種分布特點(diǎn)與其生理特性是一致的。據(jù)調(diào)查，多年來(lái)當(dāng)?shù)厝罕妼?duì)成年的白桂木采種后進(jìn)行多種方法的播種嘗試，都沒(méi)有獲得成活的植株。白桂木種子苗分化嚴(yán)重，在自然條件下播種，種子極易被動(dòng)物吃掉，這可能與白桂木種子苗中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)。如此種種，無(wú)疑大大減少了白桂木種群的自然繁殖率，使其生存受到威脅。
此外，白桂木主要生長(zhǎng)于低海拔至中海拔地區(qū)，而人們又有將其用于藥用、食用的習(xí)慣，因此，白桂木受人為干擾較大，這又加速了白桂木的瀕危。
近年來(lái)的研究結(jié)果認(rèn)為稀有、瀕危和滅絕的生物就是它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中存在某種脆弱的環(huán)節(jié)，如主要是繁殖系統(tǒng)的缺陷或基因漂變和某些物種的生物-生態(tài)學(xué)特性的特化而依賴(lài)于單一或特殊的環(huán)境、生境。這樣，近代急劇變化的環(huán)境和特殊生境的消失，使它們來(lái)不及產(chǎn)生新的變異去適應(yīng)。
白桂木的離體繁殖方法在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種白桂木的離體繁殖方法，對(duì)受威脅的瀕危植物白桂木進(jìn)行離體組培快繁殖技術(shù)的研究，以搶救該物種，使其種群得以繁衍擴(kuò)大，無(wú)論是對(duì)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)還是對(duì)白桂木的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用均具有重大的生態(tài)、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了以下的技術(shù)方案白桂木的離體繁殖方法，依次由以下步驟組成(1)、無(wú)菌外植體的獲得；以完整植株的莖尖、莖段、葉片為外植體；將莖尖、莖段用自來(lái)水沖洗干凈后，用70％酒精處理20min，無(wú)菌水沖洗3～5次，0.1％升汞處理5～10min，無(wú)菌水洗3～5次，莖尖切成長(zhǎng)約1.5cm切塊接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；葉片用自來(lái)水沖洗干凈后，用70％酒精處理30s，無(wú)菌水沖洗3～5次，0.1％升汞處理5～8min，無(wú)菌水洗3～5次。葉片切成1cm×2cm的切塊接種到誘導(dǎo)MS培養(yǎng)基中；接種時(shí)間為35天；(2)、芽的誘導(dǎo)；用培養(yǎng)基對(duì)(1)步驟中獲得的無(wú)菌外植體進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生叢芽，培養(yǎng)基為改良的MS；(3)、芽的增殖；將莖誘導(dǎo)出的直徑約0.1～0.2cm，高約0.3～0.5cm的再生芽切下，接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，莖尖開(kāi)始時(shí)基部膨大，顏色開(kāi)始轉(zhuǎn)為淡黃色，并長(zhǎng)出淡黃色到淡綠色的小芽，這些小芽培養(yǎng)約20～25天長(zhǎng)出綠色葉片，長(zhǎng)成直徑約0.1～0.3cm，高為0.5～1.5cm的從芽；(4)、根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)；將生長(zhǎng)于繼代培養(yǎng)基中的高0.5～1.0cm、帶1～2片葉的從芽切成單芽接種到含MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為30～50天，誘導(dǎo)出生根苗；
(5)、試管苗的移栽；把苗高≥1.5cm的生根苗置于培養(yǎng)室外或即將移栽的蔭棚內(nèi)練苗約10～15天，洗凈試管苗附著的培養(yǎng)基，種植到河沙∶泥炭土＝1∶8的基質(zhì)或河沙中，苗床遮蔭70～80％，保持空氣濕度50～80％以上，溫度保持在22～35℃，移栽后每3天噴施1/2MS營(yíng)養(yǎng)液，每7～10天噴施800～1000倍的百菌清等殺菌劑，移栽后約一個(gè)月植株長(zhǎng)出新根；待苗長(zhǎng)出3-4片葉片，高約5cm即可移植到營(yíng)養(yǎng)杯中，基質(zhì)采用塘泥∶泥炭土∶粗沙＝3∶6∶1；杯苗置遮蔭40～60％的室外，并逐漸移去遮蔭網(wǎng)，新根長(zhǎng)出，苗高約≥25cm，即可定植；所述的外植體為母株種子苗優(yōu)株的莖尖、莖段、葉片。
所述的外植體也可以采用無(wú)菌播種所得的實(shí)生苗的莖尖、莖段、葉片。
上述無(wú)菌播種的方法如下種子采后馬上用自來(lái)水沖洗，晾干，第二天用70％酒精處理10～15秒，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞消毒3分鐘；無(wú)菌水沖洗五次后接種到MS培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，溫度保持在28℃，培養(yǎng)時(shí)間為30天，30天后長(zhǎng)出具有根、莖、葉的完整植株。
同已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明對(duì)受威脅的瀕危植物白桂木進(jìn)行離體組培快繁殖技術(shù)的研究，以搶救該物種，使其種群得以繁衍擴(kuò)大；并利用離體組培的方法大量提供了珍稀植物白桂木的優(yōu)良組培苗，對(duì)保存和保護(hù)瀕危植物白桂木并對(duì)其加以開(kāi)發(fā)利用具有重要的生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明附圖1為本發(fā)明的主要技術(shù)路線(xiàn)示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1白桂木的離體繁殖方法，依次由以下步驟組成(1)、無(wú)菌外植體的獲得；以母株種子苗優(yōu)株的莖尖、莖段、葉片為外植體；將莖尖、莖段用自來(lái)水沖洗干凈后，用70％酒精處理20min，無(wú)菌水沖洗5次，0.1％升汞處理10min，無(wú)菌水洗4次，莖尖切成長(zhǎng)1.5cm切塊接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。母株莖的成功率3％，一年生的莖成功率在5％。材料接種的7天內(nèi)，有的切口有淡褐色的物質(zhì)分泌出來(lái)并有水浸狀，這樣的材料慢慢會(huì)死去，有的則轉(zhuǎn)為綠色，切口處膨大，但無(wú)愈傷組織，在接種約25天后開(kāi)出小芽。葉片用自來(lái)水沖洗干凈后，用70％酒精處理30s，無(wú)菌水沖洗4次，0.1％升汞處理8min，無(wú)菌水洗4次。葉片切成1cm×2cm的切塊接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；接種時(shí)間為35天，成功率在30％。從葉誘導(dǎo)的芽的生長(zhǎng)與莖的相似，但小芽從葉柄和葉片的切口長(zhǎng)出。
(2)、芽的誘導(dǎo)；用培養(yǎng)基對(duì)(1)步驟中獲得的無(wú)菌外植體進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生叢芽，培養(yǎng)基為改良的MS；(3)、芽的增殖；
將莖誘導(dǎo)出的直徑0.15cm，高0.4cm的再生芽切下，接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，莖尖開(kāi)始時(shí)基部膨大，顏色開(kāi)始轉(zhuǎn)為淡黃色，并長(zhǎng)出淡黃色到淡綠色的小芽，這些小芽培養(yǎng)25天長(zhǎng)出綠色葉片，長(zhǎng)成直徑0.2cm，高為1.0cm的從芽；(4)、根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)；將生長(zhǎng)于繼代培養(yǎng)基中的高0.8cm、帶2片葉的從芽切成單芽接種到含基本培養(yǎng)基為1/2MS，含不同的濃度的NAA、IBA、IAA、或活性炭的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果如下(表1)。實(shí)驗(yàn)均誘導(dǎo)出生根苗，但生根率有較大的差別，其中接種在NAA為0.05和加入活性炭組為最好，30天后植株基部長(zhǎng)出粗壯新根，植株長(zhǎng)高，根長(zhǎng)為0.5-2cm，生根率分別為90、92％(表2)。但NAA過(guò)高則抑制了根的生長(zhǎng)。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，接種在NAA為0.5或活性炭培養(yǎng)基中進(jìn)生根的單芽若高≥0.5cm都能生根，且平均生根率都可達(dá)90％，較小的苗在生根階段仍繼續(xù)生長(zhǎng)，但其出瓶的苗若根數(shù)≥1條，高約≥1.5cm，則成活率高達(dá)85.6％，但若單芽太小〔高約＜1.0cm＝，即使已生根，移栽的成活率則只有57.4％(表3)。因此，如果進(jìn)入根的芽較高(≥0.8cm)，則生根階段約30天即可出瓶，若接種的芽較小(高約0.5cm)，則生根階段要60天，待苗高≥1.5cm才可出瓶。根據(jù)白桂木的這一生根特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)的安排。
表1生根實(shí)驗(yàn)培育基表
說(shuō)明基本培養(yǎng)基為1/2MB，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及活性炭用量單位為mg/L。
表2白桂木根的誘導(dǎo)生根率統(tǒng)計(jì)表
(5)、試管苗的移栽；把苗高≥1.5cm的生根苗置于培養(yǎng)室外或即將移栽的蔭棚內(nèi)練苗約14天，洗凈試管苗附著的培養(yǎng)基，種植到河沙∶泥炭土＝1∶8的基質(zhì)或河沙中，苗床遮蔭75％，保持空氣濕度80％，溫度保持在32℃，移栽后每3天噴施1/2MS營(yíng)養(yǎng)液，每8天噴施900倍的百菌清等殺菌劑。移栽后約一個(gè)月植株長(zhǎng)出新根，移栽成活率為77.7-95.1％，平均為85.6％(表3)，從我們2003年3月7日出瓶的成活率來(lái)看，以6月的成活率最高，且苗高≥1.5cm的成活率顯著大于苗高＜1.5cm的瓶苗。待苗長(zhǎng)出4片葉片，高5cm即可移植到營(yíng)養(yǎng)杯中，基質(zhì)采用塘泥∶泥炭土∶粗沙＝3∶6∶1。杯苗置遮蔭60％的室外，并逐漸移去遮蔭網(wǎng)，新根長(zhǎng)出，苗高≥25cm，即可定植。至2003年8月，我們已出瓶苗3000多株，其中室外篩苗1608株，可供定植的500多株。
表3白桂木成苗率統(tǒng)計(jì)表
實(shí)施例2方法與實(shí)施例1相同，但其步驟(1)中的外植體是采用無(wú)菌播種所得的實(shí)生苗的莖尖、莖段、葉片。這種方法較之實(shí)施例1而言速度較快。
上述無(wú)菌播種的方法如下種子采后馬上用自來(lái)水沖洗，晾干，第二天用70％酒精處理10～15秒，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞消毒3分鐘；無(wú)菌水沖洗五次后接種到MS培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，溫度保持在28℃，培養(yǎng)時(shí)間為30天，30天后長(zhǎng)出具有根、莖、葉的完整植株。
2002年8月采集種子26粒，種子采后馬上用自來(lái)水沖洗，晾干，第二天用70％酒精處理12秒，無(wú)菌水沖洗4次，再用0.1％升汞消毒3分鐘；無(wú)菌水沖洗五次后接種到1/2MS培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，溫度保持在28℃，培養(yǎng)時(shí)間為30天，30天后有23粒種子出芽，并長(zhǎng)出具有根、莖、葉的完整植株。
結(jié)論關(guān)于離體培養(yǎng)1、白桂木的莖、種子的表面平滑，在實(shí)驗(yàn)中用一般的消毒方法，無(wú)論用上述的哪一種材料均較易得到無(wú)菌外植體，但從保持母本的遺傳性狀來(lái)考慮，應(yīng)以?xún)?yōu)良母株的莖來(lái)誘導(dǎo)芽。
2、在芽的誘導(dǎo)中，用常用的MS培養(yǎng)基，曾試用與6-BA、KT、NAA、IBA、ADE、ZT等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑搭配及其多種梯度的組合實(shí)驗(yàn)，材料有的不萌動(dòng)、有的變褐，均無(wú)法誘導(dǎo)出芽，后來(lái)我們用改良的MS(及上述的MB)培養(yǎng)基，則誘導(dǎo)出大量的從芽，推測(cè)白桂木的從芽的生長(zhǎng)需要特定的營(yíng)養(yǎng)。
3、實(shí)驗(yàn)表明，在生根培養(yǎng)基中，小芽(高約0.5cm、直徑約0.1cm)與大芽(高約1.5cm、直徑約0.3cm)生根率并無(wú)多大的差別，均可達(dá)90％以上。但對(duì)于較大(高大于1.5cm)生根苗，即使只有一條根，仍可成活，而對(duì)于較小的瓶苗(高約0.5cm、直徑約0.1cm)，即使有3-4條根，最后仍干枯而死。這表明白桂木的小苗生長(zhǎng)要有充分的養(yǎng)分積累。
權(quán)利要求
1.白桂木的離體繁殖方法，其特征在于該方法依次由以下步驟組成(1)、無(wú)菌外植體的獲得；以完整植株的莖尖、莖段、葉片為外植體；將莖尖、莖段用自來(lái)水沖洗干凈后，用70％酒精處理20min，無(wú)菌水沖洗3～5次，0.1％升汞處理5～10min，無(wú)菌水洗3～5次，莖尖切成長(zhǎng)1.5cm切塊接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；葉片用自來(lái)水沖洗干凈后，用70％酒精處理30s，無(wú)菌水沖洗3～5次，0.1％升汞處理5～8min，無(wú)菌水洗3～5次。葉片切成1cm×2cm的切塊接種到誘導(dǎo)MS培養(yǎng)基中；接種時(shí)間為35天；(2)、芽的誘導(dǎo)；用培養(yǎng)基對(duì)(2)步驟中獲得的無(wú)菌外植體進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生叢芽，培養(yǎng)基為改良的MS；(3)、芽的增殖；將莖誘導(dǎo)出的直徑0.1～0.2cm，高0.3～0.5cm的再生芽切下，接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，莖尖開(kāi)始時(shí)基部膨大，顏色開(kāi)始轉(zhuǎn)為淡黃色，并長(zhǎng)出淡黃色到淡綠色的小芽，這些小芽培養(yǎng)20～25天長(zhǎng)出綠色葉片，長(zhǎng)成直徑0.1～0.3cm，高為0.5～1.5cm的從芽；(4)、根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)；將生長(zhǎng)于繼代培養(yǎng)基中的高0.5～1.0cm、帶1～2片葉的從芽切成單芽接種到含MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為30～50天，誘導(dǎo)出生根苗；(5)、試管苗的移栽；把苗高≥1.5cm的生根苗置于培養(yǎng)室外或即將移栽的蔭棚內(nèi)練苗10～15天，洗凈試管苗附著的培養(yǎng)基，種植到河沙∶泥炭土＝1∶8的基質(zhì)，或河沙中，苗床遮蔭70～80％，保持空氣濕度50～80％以上，溫度保持在22～35℃，移栽后每3天噴施1/2MS營(yíng)養(yǎng)液，每7～10天噴施800～1000倍的百菌清等殺菌劑，移栽后一個(gè)月植株長(zhǎng)出新根；待苗長(zhǎng)出3-4片葉片，高5cm即可移植到營(yíng)養(yǎng)杯中，基質(zhì)采用塘泥∶泥炭土∶粗沙＝3∶6∶1；杯苗置遮蔭40～60％的室外，并逐漸移去遮蔭網(wǎng)，新根長(zhǎng)出，苗高≥25cm，即可定植；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白桂木的離體繁殖方法，其特征在于所述的外植體為母株種子苗優(yōu)株的莖尖、莖段、葉片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白桂木的離體繁殖方法，其特征在于所述的外植體采用無(wú)菌播種所得的實(shí)生苗的莖尖、莖段、葉片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的白桂木的離體繁殖方法，其特征在于上述無(wú)菌播種的方法如下種子采后馬上用自來(lái)水沖洗，晾干，第二天用70％酒精處理10～15秒，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞消毒3分鐘；無(wú)菌水沖洗五次后接種到MS培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，溫度保持在28℃，培養(yǎng)時(shí)間為30天，30天后長(zhǎng)出具有根、莖、葉的完整植株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了白桂木的離體繁殖方法。該方法由以下步驟組成(1)無(wú)菌外植體的獲得、(2)芽的誘導(dǎo)、(3)芽的增殖、(4)根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)、(5)試管苗的移栽。本發(fā)明對(duì)受威脅的瀕危植物白桂木進(jìn)行離體組培快繁殖技術(shù)的研究，以搶救該物種，使其種群得以繁衍擴(kuò)大；并利用離體組培的方法大量提供了珍稀植物白桂木的優(yōu)良組培苗，對(duì)保存和保護(hù)瀕危植物白桂木并對(duì)其加以開(kāi)發(fā)利用具有重要的生態(tài)效益、社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1557142SQ20041001509
公開(kāi)日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2004年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月13日
發(fā)明者劉頌頌, 葉永昌, 招曉東 申請(qǐng)人:東莞市林業(yè)科學(xué)研究所