專(zhuān)利名稱(chēng)：狐尾藻工程苗快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速生產(chǎn)狐尾藻優(yōu)質(zhì)工程苗的方法。
背景技術(shù)：
狐尾藻(Myriophyllum spicatum Linn.)為小二仙草科狐尾藻屬一種水生草本植物，生長(zhǎng)在池塘、湖沼或水稻田中。該植物對(duì)水體污染具有較高的耐受性，在富營(yíng)養(yǎng)化水體生態(tài)修復(fù)工程中常被用作凈水工具種和植被恢復(fù)先鋒物種。該植物還被廣泛栽植于魚(yú)、蝦和蟹塘中，不僅可以為上述水產(chǎn)品提供餌料，也可以為之提供必要的避難和產(chǎn)卵場(chǎng)所。另外，在室內(nèi)觀(guān)賞水族養(yǎng)殖過(guò)程中，該植物也是常用的造景材料。
目前市場(chǎng)上對(duì)狐尾藻種苗需求量很大。但有關(guān)狐尾藻的研究都集中在其自然種群的分布、其耐污性與凈水效果、以及其在魚(yú)蝦蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用。在實(shí)踐過(guò)程中，狐尾藻種源都采集于自然環(huán)境。該植物莖柔軟而多分枝，打撈過(guò)程中根系多遭受?chē)?yán)重破壞，且植株間大小不一，不利于其成功移植。另外，自然來(lái)源的狐尾藻帶有各種雜藻雜菌，不利于魚(yú)蝦蟹塘和室內(nèi)觀(guān)賞水族缸中的安全使用。最后自然環(huán)境中狐尾藻種源有限，過(guò)量采集容易導(dǎo)致其原生生境的破壞。
迄今國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有關(guān)狐尾藻無(wú)菌苗的培養(yǎng)及其大規(guī)模人工繁殖的研究與報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，獲得并在室內(nèi)大規(guī)模繁殖狐尾藻工程苗，并盡量保持其無(wú)菌，以克服該物種野外收集有限且污染嚴(yán)重的弊端，適應(yīng)我國(guó)淡水湖泊植被恢復(fù)、野外魚(yú)蝦蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖以及室內(nèi)觀(guān)賞水族布景的需要。本發(fā)明的技術(shù)方案是1.狐尾藻無(wú)菌芽的獲得從野外自然生境中采集狐尾藻植株，剪取幼嫩芽段，于肥皂水中浸泡2h以上，用自來(lái)水沖洗干凈。在超凈工作室中，用70％乙醇浸泡一定時(shí)間，再用適當(dāng)濃度的NaClO漂白劑并一定比例的Tween-80浸泡一定時(shí)間，用無(wú)菌水徹底漂洗后接種于培養(yǎng)液①(見(jiàn)表1)中，并置于組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)。室內(nèi)平均光照強(qiáng)度2000lx，每日光照10h，溫度為25℃左右。期間注意觀(guān)察，隨時(shí)剔除仍然污染的材料，以免交叉感染。
2.狐尾藻叢芽的擴(kuò)增由上述步驟獲得的無(wú)菌個(gè)體經(jīng)過(guò)2周培養(yǎng)后，多數(shù)莖葉已明顯伸長(zhǎng)，并有側(cè)芽長(zhǎng)出。于超凈工作室中，將所有2cm以上的側(cè)芽切下，過(guò)長(zhǎng)的莖段再以每2cm長(zhǎng)度切小，將每段轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)液①中。以后每隔2周將長(zhǎng)大的材料按上述方法重復(fù)切割，以獲得足夠多的無(wú)菌芽。上述擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程仍在組培室中進(jìn)行，光照和溫度不變。
3.狐尾藻生根與完整苗的誘導(dǎo)取上述步驟2獲得無(wú)菌側(cè)芽，同樣保持在2cm左右，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)液②(見(jiàn)表1)中，繼續(xù)在組培室中培養(yǎng)10d以上，誘導(dǎo)材料生根并形成完整幼苗。組培室中光照和溫度不變。
表1.狐尾藻培養(yǎng)液①、②配方為
*上述培養(yǎng)液按濃度配好后均用稀HCl或NaOH調(diào)整pH到5.7，分裝到100mL三角瓶中，用封口膜包扎后于121℃、0.1MPa左右濕熱滅菌18min。
4.狐尾藻工程苗的壯苗將上述培養(yǎng)液②中莖長(zhǎng)6cm以上，并至少帶有2根2cm以上根的狐尾藻幼苗取出，移栽到底部鋪有滅過(guò)菌的沙石的大玻璃缸中。保持水深50cm以上，每周換水并添加一定量Hoagland營(yíng)養(yǎng)液以促進(jìn)其生長(zhǎng)。當(dāng)室外白晝氣溫20℃以上時(shí)，將玻璃缸置于室外，直接利用太陽(yáng)光照；否則，將玻璃缸置于溫室中，晝夜溫度分別保持18℃和25℃以上，并在白天適當(dāng)補(bǔ)充人工光照。上述培養(yǎng)保持到植株長(zhǎng)至40cm以上。
5.狐尾藻工程苗的應(yīng)用上述通過(guò)步驟3培養(yǎng)后收獲的莖長(zhǎng)6cm以上、根系發(fā)達(dá)的健康狐尾藻小苗，直接應(yīng)用于室內(nèi)觀(guān)賞水族布景。具體操作方法為先用自來(lái)水將植株上殘留的培養(yǎng)液沖洗干凈，以防粘附培養(yǎng)液對(duì)觀(guān)賞水族的污染，然后根據(jù)布景的需要，插植于水族缸底沙中。上述通過(guò)步驟4培養(yǎng)后獲得的株高40cm以上、根系發(fā)達(dá)的健康狐尾藻植株，應(yīng)用于魚(yú)蝦蟹塘的養(yǎng)殖以及大型湖泊水體生態(tài)修復(fù)工程中。具體操作方法為從大玻璃缸中挖取健康狐尾藻植株，注意保持其根系完整，采用黑暗和保濕方式迅速運(yùn)抵目標(biāo)地后，根椐魚(yú)蝦蟹苗投放量或水體富營(yíng)養(yǎng)和植被退化程度決定狐尾藻栽種密度，并根據(jù)實(shí)際需要，采用單株或叢株移栽，以及單一物種移栽或與其它物種混合移栽。
本發(fā)明的效果在于1)獲得了狐尾藻無(wú)菌苗。野外采集的狐尾藻原材料本身污染嚴(yán)重，而該水草莖葉細(xì)嫩，又兼有吸收能力，使其滅菌過(guò)程具有相當(dāng)難度。本技術(shù)先采用較溫和的肥皂水浸洗，初步降低污染后，再以乙醇、NaClO漂白劑以及Tween-80共同作用，徹底滅菌。通過(guò)該程序，在保證平均無(wú)菌率60％的基礎(chǔ)上，材料存活率可保證在50％以上。再利用合適的培養(yǎng)液和激素配比，分別誘導(dǎo)出叢芽和根，并最終獲得完整無(wú)菌苗。經(jīng)過(guò)馴化培養(yǎng)的狐尾藻無(wú)菌芽，在培養(yǎng)液①中每2周的增殖率在1∶30以上(即每個(gè)單芽經(jīng)2周培養(yǎng)后，至少可獲得30個(gè)以上叢芽)，同時(shí)在培養(yǎng)液②中，材料的生根率也在80％以上。
2)建立了狐尾藻工程苗快速繁殖途徑。本技術(shù)在獲得狐尾藻無(wú)菌芽的基礎(chǔ)上，直接利用其側(cè)芽進(jìn)行分割繁殖，步驟簡(jiǎn)單，操作方便。所用試劑均為常規(guī)化工產(chǎn)品，成本低廉，便于其大規(guī)模工廠(chǎng)化生產(chǎn)。期間未涉及愈傷組織的脫分化和分化過(guò)程，盡量避免了組織培養(yǎng)過(guò)程中遺傳變異的可能性，一旦獲得無(wú)菌種芽，即可進(jìn)行長(zhǎng)期擴(kuò)增繁殖。
本項(xiàng)發(fā)明可不分季節(jié)，隨時(shí)為湖泊植被恢復(fù)、魚(yú)蝦蟹塘養(yǎng)殖以及室內(nèi)水族觀(guān)賞布景提供足夠的狐尾藻優(yōu)質(zhì)工程苗。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1.于2003年10月從南京江浦縣采集狐尾藻種源，剪取2cm長(zhǎng)的芽段5個(gè)，于肥皂水中浸泡4h后用自來(lái)水漂洗。進(jìn)入超凈工作室中，用70％乙醇浸泡數(shù)秒，再用稀釋適當(dāng)比例并含有一定量Tween-80的NaClO漂白劑浸泡數(shù)分鐘，用無(wú)菌水徹底漂洗后，將每個(gè)芽單獨(dú)接種于含培養(yǎng)液①并已滅菌的的封口三角瓶中，于組培室中培養(yǎng)。平均光照強(qiáng)度2000lx，每日光照10h，溫度25℃左右。此后經(jīng)觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)其中2瓶仍然污染，而另3瓶無(wú)菌并在幾天后開(kāi)始明顯返綠。2周后于超凈工作室中將3瓶材料中的每個(gè)2cm以上的側(cè)芽切下并單獨(dú)接種于新的培養(yǎng)液①中，共得11瓶。繼續(xù)培養(yǎng)2周后再次切割，并以每5個(gè)芽為一瓶，接種到培養(yǎng)液②中，共為62瓶。20d后收獲莖長(zhǎng)6cm以上，且至少帶2個(gè)2cm以上根的完整狐尾藻無(wú)菌苗272株。2004年1月將這些健康小苗用于觀(guān)賞水族布景。
實(shí)例2.于2003年11月從蘇州東太湖采得狐尾藻種源，剪取2cm長(zhǎng)的芽段20個(gè)，于肥皂水中浸泡4h后用自來(lái)水漂洗。進(jìn)入超凈工作室中，用70％乙醇浸泡數(shù)秒，再用稀釋適當(dāng)比例并含有一定量Tween-80的NaClO漂白劑繼續(xù)消毒。用無(wú)菌水徹底漂洗后，將每個(gè)芽單獨(dú)接種于培養(yǎng)液①中，于組培室中培養(yǎng)。平均光照強(qiáng)度2000lx，每日光照10h，溫度25℃左右。2周內(nèi)共剔除污染材料11份，另9份材料中有5份明顯增長(zhǎng)。初次切割后共獲得48個(gè)側(cè)芽，繼續(xù)培養(yǎng)于培養(yǎng)液①中。此后每隔2周分割一次并轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)液①中以誘導(dǎo)更多叢生芽。2個(gè)月后，將新生芽轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)液②中以誘導(dǎo)生根。15d后將完整小苗取出，移栽到鋪有滅過(guò)菌的沙石的大玻璃缸中，并在溫室中培養(yǎng)。每周換水且補(bǔ)充Hoagland營(yíng)養(yǎng)液以壯苗。該批材料將被應(yīng)用于太湖富營(yíng)養(yǎng)化水體生態(tài)修復(fù)工程中。
權(quán)利要求
1.一種狐尾藻無(wú)菌苗培養(yǎng)及其工程苗快速擴(kuò)繁的方法，其特征為該方法由以下步驟組成1)經(jīng)過(guò)一系列滅菌過(guò)程，獲得狐尾藻無(wú)菌芽；2)將原生無(wú)菌芽接種于以Ms為基本成分并附加有一定量激素的培養(yǎng)液①中以誘導(dǎo)叢生芽，并每隔2周將2cm以上長(zhǎng)度的新芽切下并接種到新的培養(yǎng)液①中以不斷擴(kuò)增直到獲得足夠多材料；3)將新芽同樣切割下來(lái)后轉(zhuǎn)接到以Ms為基本成分但激素類(lèi)型和含量有所變化的培養(yǎng)液②中以誘導(dǎo)生根；4)將培養(yǎng)液②培養(yǎng)到莖長(zhǎng)6cm以上，根系發(fā)達(dá)的幼苗轉(zhuǎn)到大玻璃缸中，補(bǔ)充Hoagland營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)壯苗，直到植株長(zhǎng)至40cm以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述狐尾藻工程苗在湖泊植被恢復(fù)工程中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述狐尾藻工程苗在魚(yú)蝦蟹養(yǎng)殖過(guò)程中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述狐尾藻工程苗在室內(nèi)觀(guān)賞水族養(yǎng)殖過(guò)程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。運(yùn)用狐尾藻組織培養(yǎng)技術(shù)，獲得并大規(guī)模擴(kuò)繁其優(yōu)質(zhì)工程苗，以克服該物種在自然環(huán)境中種源有限且污染嚴(yán)重的問(wèn)題。滿(mǎn)足目前湖泊生態(tài)修復(fù)工程中作為凈水工具種和植被恢復(fù)先鋒物種、魚(yú)蝦蟹塘養(yǎng)殖過(guò)程中作為餌料、避難和產(chǎn)卵場(chǎng)所，以及室內(nèi)觀(guān)賞水族養(yǎng)殖過(guò)程中作為布景材料的迫切需要。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1559184SQ200410014210
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月4日
發(fā)明者周長(zhǎng)芳, 安樹(shù)青, 尹大強(qiáng), 蔣金輝 申請(qǐng)人:南京大學(xué)