專利名稱：一種植物脫病毒快速繁殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無(wú)性繁殖植物脫病毒快速繁殖的方法，具體地說(shuō)，涉及一種誘導(dǎo)植物進(jìn)入種子繁殖階段，形成種子或未成熟種子(胚)，檢驗(yàn)其是否帶毒，取無(wú)病毒種子胚進(jìn)行組培擴(kuò)大，然后進(jìn)行快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
無(wú)性繁殖植物病毒病的發(fā)生相對(duì)普遍和嚴(yán)重，所有的植物病毒無(wú)一例外均可以通過(guò)無(wú)性繁殖方式(扦插、嫁接和)垂直傳播。該類植物由于沒有種子繁殖過(guò)程，因此其病毒表現(xiàn)逐漸累積和終身帶毒的特點(diǎn)。病毒的長(zhǎng)期大量累積，造成無(wú)性繁殖植物的種質(zhì)退化。同時(shí)，普遍帶毒(幾乎所有木本和塊莖塊根繁殖的植物都100％攜帶病毒)的植物在自身的生命力下降的同時(shí)，引發(fā)病毒擴(kuò)散，可能使周邊農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物遭受病毒的危害，因此，對(duì)無(wú)性繁殖植物進(jìn)行病毒檢測(cè)是一項(xiàng)非常有價(jià)值得工作，尤其是當(dāng)植物材料來(lái)自外地、外國(guó)銷售品和需要異地?cái)U(kuò)散時(shí)，病毒檢測(cè)和無(wú)病毒繁殖體的采用尤為重要。通過(guò)組織培養(yǎng)脫除病毒，獲得純凈的植物繁殖體，不僅可以恢復(fù)植物生長(zhǎng)活力，獲得“復(fù)壯”效果，同時(shí)還能夠大大提高植物產(chǎn)品的環(huán)境安全性，保障產(chǎn)品銷售環(huán)節(jié)暢通。組織培養(yǎng)獲得的無(wú)病毒苗，由于可以從一株母體上獲得遺傳基礎(chǔ)和外觀、品質(zhì)形狀均一的繁殖體和產(chǎn)品，對(duì)于形成植物產(chǎn)品品牌具有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。
組培與脫病毒苗生產(chǎn)的關(guān)鍵是脫毒技術(shù)。獲得無(wú)病毒植株的方法有多種，例如熱處理脫毒、芽尖培養(yǎng)脫毒和莖尖微芽嫁接脫毒以及其組合方法。普遍采用的較好的方法是芽尖培養(yǎng)脫毒法，具體的步驟是通過(guò)植物頂端分生組織切取小塊(0.2mm以下分生組織)，用各部位器官和組織的培養(yǎng)去分化誘導(dǎo)愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長(zhǎng)成小植株得到脫毒苗是目前通常采用的方法。相關(guān)的技術(shù)已有許多的專利。例如，CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A披露了采用芽尖組織作為外植體，用消毒劑消毒處理后進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到脫毒苗的方法。WO00/78128公開了培養(yǎng)球莖或塊莖葉基部分的園頂形組織，獲得無(wú)毒植物的方法。JP5130816A、JP5084028A公開了一種采用葉芽或苗尖作為外植體在含有6-BA、激動(dòng)素等激素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得無(wú)病毒人工草莓的方法。
但是這種分生組織脫毒法存在二個(gè)問(wèn)題1)但由于植物愈傷組織中病毒濃度降低的原因目前還存在著爭(zhēng)議，獲得的脫毒苗不一定完全脫毒，因此需要對(duì)大量樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)，而病毒檢測(cè)往往存在靈敏度的問(wèn)題；2)需要切取小塊頂端分生組織，具有一定難度，切取組織越小，成活率越低，同時(shí)，容易造成污染；3)切取組織越小越容易導(dǎo)致變異發(fā)生。
因此，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍就需要一種更好的脫毒方法。
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明者進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，結(jié)果發(fā)明，通過(guò)誘導(dǎo)植物種子胚形成，檢驗(yàn)其是否帶毒，取無(wú)病毒種子胚(一種未成熟種子形式)進(jìn)行組培擴(kuò)大，然后進(jìn)行快速繁殖的方法，于是完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的脫病毒方法，它包括如下步驟，通過(guò)誘導(dǎo)植物進(jìn)入種子繁殖階段，形成種子或未成熟種子(胚)，檢驗(yàn)種子胚是否帶毒，取無(wú)病毒種子胚進(jìn)行組培擴(kuò)大，獲得大量獲得低病毒負(fù)荷量的繁殖體，然后進(jìn)行快速繁殖的方法。
本發(fā)明中所述的植物是指在自然條件下不易產(chǎn)生種子的植物，例如，蘭科、天南星科、旋花科和姜科植物等，優(yōu)選蘭科、天南星科、旋花科植物。
蘭科植物可以是例如蘭科藥用植物如石斛、金線蓮、天麻、蘭科花卉植物如中國(guó)蘭、大花蕙蘭，優(yōu)選蘭科藥用植物石斛如鐵皮石斛、金線蓮、天麻，蘭科花卉植物如蘭花。
天南星科植物可以是例如半夏、魔芋、芋頭、海芋、象耳芋、萬(wàn)年青，優(yōu)選半夏、魔芋、芋頭。
本文中所述的種子繁殖階段形成的是例如未成熟種子胚、未成熟種子和種子，優(yōu)選未成熟種子胚。
所述的無(wú)病毒種子胚可以是上述的未成熟種子胚，也可以取自長(zhǎng)在種子或未成熟種子之中種子胚。
本文中所述的病毒指RNA病毒、類病毒、DNA病毒和植物菌原體，優(yōu)選是RNA病毒。
本發(fā)明方法中，通過(guò)激素處理所獲得的低病毒負(fù)荷量繁殖體的隨后快速繁殖采用常規(guī)的方法進(jìn)行，例如，組培脫毒前，將整株植物經(jīng)過(guò)茉莉酸類似物處理。
與現(xiàn)有的各種植物脫毒方法相比，本發(fā)明的方法具有脫毒成功率更高的優(yōu)點(diǎn)。無(wú)病毒半夏比野生半夏在2年的栽培試驗(yàn)對(duì)比中，產(chǎn)量增加至138％～400％，品質(zhì)明顯改觀。
實(shí)施例本發(fā)明通過(guò)下文的非限定性實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。
實(shí)施例1掌葉半夏選取品質(zhì)上乘的掌葉半夏(Pinellia cordata)40個(gè)種球進(jìn)行盆栽，在43d～60d內(nèi)開始出現(xiàn)花蕾，用不同株進(jìn)行人工授粉雜交，25天內(nèi)獲得未成熟種籽，通過(guò)未成熟種籽的培養(yǎng)去分化誘導(dǎo)愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，獲得新生植株。分別用DsMV基因組的3′末端序列，5 ′-α-32P作標(biāo)記制備DNA探針，對(duì)新的植株進(jìn)行病毒RNA點(diǎn)雜交檢測(cè)，確定99％的植株確定不攜帶該病毒。以不攜帶DsMV病毒的掌葉半夏珠芽，進(jìn)行消毒組培，獲得組培苗，形成新的無(wú)病毒優(yōu)質(zhì)種苗。
實(shí)施例2盾葉半夏選取個(gè)體均一、品質(zhì)優(yōu)良的盾葉半夏(Pinellia ternata)30個(gè)種球進(jìn)行盆栽，在36～55內(nèi)進(jìn)入開花期，開花前期采用異株人工授粉雜交，37天內(nèi)獲得種籽，無(wú)菌水浸種處理生芽，再在無(wú)菌條件下切取新芽頂端分生組織接種在MS培養(yǎng)基上，附加一定的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，誘導(dǎo)產(chǎn)生新芽，獲得新植株。分別用DsMV基因組的3′末端序列及為模板制備DNA探針，對(duì)新的植株進(jìn)行病毒RNA點(diǎn)雜交檢測(cè)，確定98％的植株確定不攜帶該病毒。以不攜帶DsMV病毒的盾葉半夏珠芽，進(jìn)行消毒組培，獲得組培苗，形成新的無(wú)病毒優(yōu)質(zhì)種苗。
實(shí)施例3芋頭選取品質(zhì)上乘的芋頭30個(gè)種球進(jìn)行盆栽，在連續(xù)短日照處理30d；每天3h強(qiáng)光照，其余時(shí)間暗處理，48天獲得開花，異株人工授粉雜交，獲得種子，無(wú)菌水浸種處理生芽，再在無(wú)菌條件下切取新芽頂端分生組織接種在MS培養(yǎng)基上，附加一定的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，誘導(dǎo)產(chǎn)生新芽，獲得新植株。分別用DsMV基因組的3′末端序列及為模板制備DNA探針，對(duì)新的植株進(jìn)行病毒RNA點(diǎn)雜交檢測(cè)，確定98％的植株確定不攜帶該病毒。以不攜帶DsMV病毒的盾葉半夏珠芽，進(jìn)行消毒組培，獲得組培苗，形成新的無(wú)病毒優(yōu)質(zhì)種苗。
對(duì)照實(shí)施例盾葉半夏將盾葉半夏單個(gè)的幼嫩塊莖(直徑1厘米)分割成50個(gè)切片葉片，經(jīng)75％的酒精浸泡0.5～1min，再用2％的次氯酸鈉水溶液消毒15min，或用0.1％氯化汞水溶液消毒10min，然后在無(wú)菌條件下用無(wú)菌水沖洗，再在無(wú)菌條件下切段(塊)接種在適宜的培養(yǎng)基上，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，蔗糖3％，瓊脂0.7％，PH5.8，附加一定的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，誘導(dǎo)半夏愈傷組織生成和器官分化。培養(yǎng)溫度25±2℃，光強(qiáng)1500LX，光照時(shí)間10～12h/d。熱處理，莖尖培養(yǎng)(0.5～0.2mn)，愈傷組織誘導(dǎo)成苗。
雖然，在本文中對(duì)本發(fā)明原理及方法作了詳盡的說(shuō)明，但可以理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上可以做出改進(jìn)或變化，這些內(nèi)容也屬于本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種植物脫病毒方法，它包括如下步驟誘導(dǎo)植物進(jìn)行種子繁殖階段，形成種子、未成熟種子或種子胚，檢驗(yàn)其是否帶毒，取無(wú)病毒種子胚進(jìn)行組培擴(kuò)大，然后進(jìn)行快速繁殖的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述的無(wú)病毒種子胚是未成熟種子胚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述的植物選自蘭科、天南星科、旋花科和姜科。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，所述的植物選自蘭科和天南星科。
5.根據(jù)權(quán)利要求4之的方法，其中，所述的植物材料選自鐵皮石斛、金線蓮、天麻、半夏、魔芋和芋頭。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之任一的方法，其中，所述的病毒選自RNA病毒、類病毒、DNA病毒和植物菌原體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中，所述的病毒為RNA病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無(wú)性繁殖植物脫病毒快速繁殖的方法，具體地說(shuō)，涉及一種誘導(dǎo)植物進(jìn)行進(jìn)入種子繁殖階段，形成種子、未成熟種子或種子胚，檢驗(yàn)其是否帶毒，取無(wú)病毒種子胚進(jìn)行組培擴(kuò)大，然后進(jìn)行快速繁殖的方法。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1473464SQ02125978
公開日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2002年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月7日
發(fā)明者陳集雙, 陳潔云, 杜志游, 柴立紅, 劉文洪, 施利新, 谷慶琪 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 北京金長(zhǎng)河科技發(fā)展有限公司