酸－穩(wěn)定性蛋白酶在動物飼料中的用途的制作方法

專利名稱：：酸－穩(wěn)定性蛋白酶在動物飼料中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酸-穩(wěn)定性蛋白酶在動物飼料中的(體內(nèi))用途，以及這種蛋白酶處理植物蛋白質(zhì)的(體外)用途。蛋白質(zhì)是動物和人必不可少的營養(yǎng)因子。大多數(shù)牲畜和很多人從植物蛋白質(zhì)來源中攝取必需的蛋白質(zhì)。重要地植物蛋白質(zhì)來源是例如油料種子作物，豆類和谷類。例如，當(dāng)在單胃動物，如豬和家禽的飼料中含有豆粉時，大部分豆粉固體不能被消化。例如，小豬和處于生長期的豬的表觀回腸蛋白質(zhì)消化能力僅為80％左右。單胃動物和多種魚的胃表現(xiàn)出強酸性pH。然而，大多數(shù)的蛋白質(zhì)消化發(fā)生在小腸。因此，需要一種在流經(jīng)胃之后仍能存活的酸-穩(wěn)定性蛋白酶。
背景技術(shù)：
：從下列文獻(xiàn)中可以了解蛋白酶在動物飼料中的用途，或其處理植物蛋白質(zhì)的用途W(wǎng)O95/28850公開了一種含有植酸酶和蛋白酶的動物飼料添加劑。第7頁詳細(xì)說明了多種蛋白酶。WO96/05739公開了含有木聚糖酶和蛋白酶的酶飼料添加劑。第25頁列出了適當(dāng)?shù)牡鞍酌?。WO95/02044公開了得自棘孢曲霉(Aspergillusaceleatus)的蛋白酶及其在動物飼料中的用途。US3966971公開了通過用酸性植酸酶并任選一種蛋白酶處理，由植物蛋白質(zhì)來源獲取蛋白質(zhì)的方法。第2欄中詳細(xì)說明了適當(dāng)?shù)牡鞍酌?。US4073884，US5047240，US3868448，US3823072和US3683069描述了得自多個鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株的蛋白酶制品及其在動物飼料中的用途。然而，這些蛋白酶不是酸-穩(wěn)定性的和/或不與本文所述的蛋白酶同源。發(fā)明簡述本發(fā)明鑒定出的蛋白酶具有很好的酸-穩(wěn)定性，有望在動物飼料中具有改良的性能。附圖簡述以下將參照附圖進一步闡明本發(fā)明，其中圖1顯示了5種蛋白酶(2種得自擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)的酸-穩(wěn)定性蛋白酶，和3種參照蛋白酶(得自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)〔的Sub.Novo和Sub.Novo(Y217L)，以及SAVINASETM))在溫度為37℃，pH值范圍為pH2至pH11的條件下保溫2小時之后的pH-穩(wěn)定性曲線，即殘留的蛋白酶活性；所述活性是相對于在pH9.0和5℃下保溫2小時之后的殘留活性而言的；圖2顯示了相同的5種蛋白酶在pH3至pH11的范圍內(nèi)的pH-活性曲線，即蛋白酶活性，所述活性是相對于最適pH時的蛋白酶活性而言的；和圖3顯示了相同的5種蛋白酶在15℃至80℃的范圍內(nèi)，pH為9.0時的溫度-活性曲線，即pH為9.0時的蛋白酶活性，所述活性是相對于最適溫度下的蛋白酶活性而言的。發(fā)明詳述本文所用術(shù)語蛋白酶是水解肽鍵(具有蛋白酶活性)的酶。蛋白酶也被稱為例如肽酶，肽水解酶或蛋白水解酶。本發(fā)明優(yōu)選使用的蛋白酶是在多肽鏈內(nèi)部起作用的內(nèi)在(endo)-型蛋白酶(內(nèi)肽酶)。內(nèi)肽酶對N-和C-末端被封閉的肽底物顯示出活性，所述肽底物與所述蛋白酶的特異性相關(guān)。上述的蛋白酶定義中包括屬于EC目錄(源自NC-IUBMB的酶名稱1992版，1992)EC34酶組(包括其13種亞-亞類的每一種)的任何酶，該目錄被定期添加和更新，具體可參見環(huán)球網(wǎng)(www)，網(wǎng)址為http∥www.chem.qmw.ac.Luk/iubmb/enzyme/index.html。基于蛋白酶的催化機理將其分為以下幾組絲氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金屬蛋白酶(M)和未知的，或未被分類的蛋白酶(U)，參見蛋白酶手冊，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.FWoessner(編)，AcademicPress(1998)，尤其是總引言部分。本文公開的擬諾卡氏菌屬蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。在特定的實施方案中，本發(fā)明所用的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。術(shù)語絲氨酸蛋白酶指的是上述手冊中定義的絲氨酸肽酶及其異種集團。在1998年版的該手冊中，第1-175章涉及絲氨酸肽酶及其異種集團。絲氨酸蛋白酶被定義為肽酶，其催化機理依賴于絲氨酸殘基的羥基，所述羥基作為攻擊肽鍵的親核體起作用。本發(fā)明所用絲氨酸蛋白酶的例子是上述手冊中定義的SA異種集團的蛋白酶，例如S2家族(streptogrisin)，如S2A亞族(α-裂解蛋白酶)。可使用任何測定法測定蛋白酶活性，所述測定法中利用了底物，底物中包括與所述蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。類似地，使pH-試驗和溫度-試驗適應(yīng)于所述蛋白酶。pH值-試驗的例子是pH5，6，7，8，9，10或11。溫度-試驗的例子是25，30，35，37，40，45，50，55，60，65或70℃。蛋白酶底物的例子是酪蛋白和pNA-底物，如Suc-AAPF-pNA(可得自例如SigmaS-7388)。該pNA-底物中的大寫字母指的是單字母氨基酸密碼。另一個例子是ProtazymeAK(由MegazymeT-PRAK制備成片劑的經(jīng)天青精(azurine)染色的交聯(lián)酪蛋白)。pH-活性和pH-穩(wěn)定性研究優(yōu)選pNA-底物，而溫度-活性研究優(yōu)選ProtazymeAK底物。實驗部分描述了蛋白酶檢測法的例子。對本發(fā)明所用蛋白酶的來源沒有限制。因此，術(shù)語蛋白酶不僅包括天然或野生型蛋白酶，也包括其表現(xiàn)出蛋白酶活性的任何突變體，變體，片段等，以及合成的蛋白酶，如經(jīng)改組的蛋白酶和共有蛋白酶?？梢园凑毡绢I(lǐng)域公知的技術(shù)，例如通過定點誘變，PCR(使用含有所需突變的PCR片段作為PCR反應(yīng)中的一個引物)，或隨機誘變制備經(jīng)基因工程改造的蛋白酶。共有蛋白質(zhì)的制備描述于例如EP897985。本發(fā)明所用酸-穩(wěn)定性蛋白酶的例子是(i)得自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262和Nocardiopsisalba的蛋白酶；(ii)與(i)中的任何蛋白酶具有至少60，65，70，75，80，85，90或至少95％的氨基酸同一性的蛋白酶；(iii)與SEQIDNO1和/或SEQIDNO2中的任何一個具有至少60，65，70，75，80，85，90或至少95％的同一性的蛋白酶。為了計算同一性百分比，可以使用本領(lǐng)域已知的任何計算機程序。所述計算機程序的例子有ClustalV算法(Higgins，D.G和Sharp，P.M.(1989)，Gene(Amsterdam)，73，237-244)；和GCG第8版程序包中提供的GAP程序(ProgramManualfortheWisconsinPackage，Version8，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B和Wumsch，C.D.，(1970)，JoumalofMolecularBiology，48，443-453)。當(dāng)使用ClustalV算法計算兩個蛋白質(zhì)序列之間的同一性百分比時，使用PAM250殘基量(weight)表以及Lasergene軟件包(DNASTARInc.，1228SouthParkStreet，Madison，Wisconsin53715，US)中的MegAlign程序，4.03版的缺省設(shè)置。多重序列比對的缺省設(shè)置為缺口罰分為10，缺口長度罰分為10。為了計算兩個蛋白質(zhì)序列之間的同一性百分比，使用下列設(shè)置ktuple為1，缺口罰分為3，窗口為5，保存5個對角線。當(dāng)使用GAP時，使用下列設(shè)置進行多肽序列比較GAP生成罰分為5.0，GAP延伸罰分為0.3。在特定的實施方案中，本發(fā)明所用的蛋白酶是微生物蛋白酶，術(shù)語微生物表示蛋白酶得自，或源自微生物，或是得自微生物的蛋白酶類似物，片段，變體，突變體，或合成的蛋白酶?？稍谠嫉囊吧臀⑸锞辏诹硪粋€微生物菌株或在植物中產(chǎn)生或表達(dá)所述蛋白酶，即該術(shù)語覆蓋了表達(dá)野生型，天然蛋白酶，以及在任何宿主中表達(dá)重組的，經(jīng)基因工程改造的或合成的蛋白酶。本文所用術(shù)語微生物包括古細(xì)菌，細(xì)菌，真菌，病毒等。微生物的例子是細(xì)菌，例如放線細(xì)菌門新門的細(xì)菌，例如I綱Actinobacteria，V亞綱Actinobacteridae，I目Actinomycetales，XII亞目Streptosporangineae，II科Nocardiopsaceae，I屬擬諾卡氏菌屬的細(xì)菌，如擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262和Nocardiopsisalba；或其表現(xiàn)出蛋白酶活性的突變體或變體。此分類學(xué)的基礎(chǔ)是伯捷氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊，第2版，2000年，Springer(預(yù)印RoadMaptoBergey′s)。微生物的其它例子是真菌，如酵母或絲狀真菌。在另一個實施方案中，蛋白酶是植物蛋白酶。源自植物的蛋白酶的例子是得自瓜果果肉的蛋白酶(Kaneda等，J.Biochem，78，1287-1296(1975))。術(shù)語動物包括所有動物，包括人。動物的例子有非-反芻動物和反芻動物，如奶牛，綿羊和馬。在特定的實施方案中，動物是非-反芻動物。非-反芻動物包括單胃動物，如豬(包括但不限于小豬，處于生長期的豬和大母豬)；家禽，如火雞和雞(包括但不限于適于烤焙的小雞，蛋雞)；小牛；和魚(包括但不限于鮭魚)。術(shù)語飼料或飼料組合物指的是適于或給動物攝入的任何化合物，制劑，混合物或組合物。在本發(fā)明的應(yīng)用中，可在喂食之前，之后或同時給動物飼喂蛋白酶。優(yōu)選在喂食之后飼喂蛋白酶。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語酸-穩(wěn)定性指的是于37℃，在下列緩沖液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH3.5中保溫2小時之后，稀釋度相當(dāng)于A280＝1.0的純蛋白酶的蛋白酶活性至少為參照活性的40％，所述活性是使用本文實施例2C中所述的檢測法測定的(底物Suc-AAPF-pNA，pH9.0，25℃)。在上述酸-穩(wěn)定性定義的特定實施方案中，蛋白酶活性至少為參照活性的45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或至少為參照活性的97％。術(shù)語參照活性指的是稀釋度相當(dāng)于A280＝1.0的純品形式的相同蛋白酶于5℃，在下列緩沖液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH9.0中保溫2小時之后的蛋白酶活性，其中按上文所述測定活性。換句話說，測定酸-穩(wěn)定性的方法包括下列步驟a)將待測的蛋白酶樣品(純品形式，A280＝1.0)分成兩等份(I和II)；b)于37℃，pH3.5將等份I保溫2小時；c)測定等份I的殘留活性(pH9.0和25℃)；d)于5℃，pH9.0將等份II保溫2小時；e)測定等份II的殘留活性(pH9.0和25℃)；f)計算相對于等份II之殘留活性的等份I殘留活性的百分比?；蛘撸谏鲜鏊?穩(wěn)定性定義中，步驟b)緩沖液的pH值可以是1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.1，3.2，3.3或3.4。在與上述可替換的步驟b)緩沖液的pH值相關(guān)的上述酸-穩(wěn)定性定義的其它可替換的實施方案中，與參照活性相比，殘留的蛋白酶活性至少為5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或至少為97％。在其它實施方案中，步驟d)緩沖液的pH值可以是6.0，6.5，7.0，7.5，8.0或8.5。在上述酸-穩(wěn)定性定義中，術(shù)語A280＝1.0指的是在光程長度為1cm的樣品池中，280nm下相對于緩沖液空白對照的光吸收值為1.0時的所述純蛋白酶濃度(稀釋度)。在上述酸-穩(wěn)定性定義中，術(shù)語純蛋白酶指的是A280/A260的比率大于或等于1.70(見實施例2E)，且通過掃描經(jīng)考馬斯-染色的SDS-PAGE凝膠測得其掃描強度至少約為對應(yīng)于所述蛋白酶之帶的掃描強度的95％(見實施例2A)的樣品?；蛘?，A280/A260的比率大于或等于1.50，1.60，1.65，1.70，1.75，1.80，1.85，或大于或等于1.90。然而，對于本發(fā)明的應(yīng)用而言，蛋白酶不必是純的；它可以例如包括其它酶，甚至其它蛋白酶，此時可將其稱為蛋白酶制品。然而，明確定義的蛋白酶制品是有利的。例如，正確確定飼料中的蛋白酶劑量則要容易得多，所述蛋白酶基本上不含干擾的或污染的其它蛋白酶。術(shù)語正確確定劑量特指獲得持久不變的結(jié)果的目的，和基于所需結(jié)果最優(yōu)化劑量的能力。在特定的實施方案中，明確定義了添加至飼料中的，或包含在飼料添加劑中的蛋白酶。明確定義指的是經(jīng)大小排阻層析測定，蛋白酶制品至少為50％純(見實施例8)。在其它特定的實施方案中，經(jīng)此方法測定，蛋白酶制品至少為60，70，80，85，88，90，92，94純或至少為95％純。在其它實施方案中，術(shù)語明確定義指的是蛋白酶制品在適當(dāng)大小排阻柱上的分級分離僅顯示出一個主要的蛋白酶成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道如何選擇適當(dāng)?shù)拇笮∨抛鑼游鲋?。起初可以在例如AmershamPharmaciaBiotech的Hiload26/60Superdex75pg柱上分級分離蛋白酶制品(見實施例8)。如果不能清楚地分開峰，可以嘗試不同的柱(例如改變柱顆粒的大小和/或柱的長度)，和/或改變樣品的體積。通過簡單而常用的嘗試法，可以選擇出具有足夠分辨率(能清楚地分開峰)的柱，以此為基礎(chǔ)，按實施例8所述進行純度的計算。蛋白酶制品可以(a)直接加入飼料中(或直接用于植物蛋白質(zhì)的處理方法)，或(b)用于生產(chǎn)一種或多種隨后要添加至飼料中(或用于處理方法)的中間體組合物，如飼料添加劑或預(yù)混物。上文所述的純度指的是上述(a)或(b)用途中的原始蛋白酶制品的純度。使用重組生產(chǎn)方法可以特別地獲得純度為此數(shù)量級的蛋白酶制品，而當(dāng)通過傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)蛋白酶時，獲得它們卻并非易事，而且批與批之間的變化較大。當(dāng)然可以將這種蛋白酶制品與其它酶混合。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明所用的蛋白酶除了具有酸-穩(wěn)定性外，還具有接近中性的pH-活性最適值。術(shù)語接近中性的pH-活性最適值指的是下列一個或多個pH-最適值范圍為pH6.0-11.0，或pH7.0-11.0，或pH6.0-10.0，或pH7.0-10.0，或pH8.0-11.0，或pH8.0-10.0(參見本文實施例2B和圖2)。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明所用的蛋白酶除了具有酸-穩(wěn)定性外，還具有熱穩(wěn)定性。術(shù)語熱穩(wěn)定性指的是下列一個或多個溫度最適值至少為50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，或至少為70℃，參見本文實施例2D和圖3。在另一個特定的實施方案中，根據(jù)本文實施例4的體外模型，本發(fā)明所用的蛋白酶能溶解植物蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語植物蛋白質(zhì)指的是包括至少一種得自或源自植物的蛋白質(zhì)，包括經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生物的任何化合物，組合物，制品或混合物。在特定的實施方案中，植物蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量至少為10，20，30，40，50或60％(w/w)。植物蛋白質(zhì)可得自植物蛋白質(zhì)來源，例如豆類和谷類，例如豆科(Fabaceae)，十字花科(Cruciferaleae)，藜科(Chenopodiaceae)，禾本科(Poaceae)的植物材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。在特定的實施方案中，植物蛋白質(zhì)來源是豆科的一種或多種植物，如大豆，羽扇豆，豌豆或蠶豆的材料。在另一個特定的實施方案中，植物蛋白質(zhì)來源是藜科的一種或多種植物，如甜菜，糖用甜菜，菠菜或奎奴亞藜的材料。植物蛋白質(zhì)來源的其它例子是油菜籽和甘藍(lán)。大豆是優(yōu)選的植物蛋白質(zhì)來源。植物蛋白質(zhì)來源的其它例子是谷類植物，如大麥，小麥，黑麥，燕麥，玉米，水稻和高粱。根據(jù)本發(fā)明，用至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶處理植物蛋白質(zhì)導(dǎo)致植物蛋白質(zhì)的溶解性增加。以下是使用本發(fā)明的蛋白酶可以獲得的溶解蛋白質(zhì)的百分比至少為74.0％，74.5％，75.0％，75.5％，76.0％，76.5％，77.0％或至少為77.5％，參見本文實施例4的體外模型。術(shù)語溶解蛋白質(zhì)基本上指將蛋白質(zhì)釋放至溶液中。這種溶解可能是在蛋白酶的介導(dǎo)下，從通常為復(fù)合的天然組合物，如飼料的其它成分中釋放出蛋白質(zhì)而引起的。溶解可被測定為相對于未經(jīng)蛋白酶處理的樣品而言，可溶性蛋白質(zhì)量的增加(參見本文實施例4)。在處理方法的特定實施方案中，所述蛋白酶影響，或作用于植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源，或?qū)λ鼈儼l(fā)揮其溶解作用。為此，一般將植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源懸浮于溶劑，如含水溶劑，如水中，并根據(jù)所述酶的特征調(diào)節(jié)pH和溫度值。例如，可在使實際蛋白酶的相對活性至少為50，或60，或70，或80或90％的pH值下進行處理。類似地，例如，可在使實際蛋白酶的相對活性至少為50，或60，或70，或80或90％(本文實施例2中定義了這些相對活性)的溫度下進行處理。繼續(xù)進行酶反應(yīng)，直至獲得所需結(jié)果，然后，通過例如經(jīng)熱-處理步驟滅活酶，終止或不終止酶反應(yīng)。在本發(fā)明處理方法的另一個特定實施方案中，蛋白酶的作用是持久的，這意味著例如蛋白酶被加入到植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源中，但其溶解作用可以說并未啟動，直至后來在需要時，一旦建立適當(dāng)?shù)娜芙鈼l件，或一旦滅活任何酶抑制劑，或使用任何其它方法延遲酶的作用時才被啟動。在一個實施方案中，處理是對動物飼料或動物飼料中所用的植物蛋白質(zhì)進行預(yù)處理，即在攝入前溶解蛋白質(zhì)。術(shù)語改善動物飼料的營養(yǎng)價值指的是改善蛋白質(zhì)的可利用性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取物增加，蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高，和/或蛋白質(zhì)的利用情況有所改善。因此增加飼料的營養(yǎng)價值，改善動物的生長速率和/或體重的增加和/或飼料的轉(zhuǎn)化(即相對于增加的體重而言所攝取飼料的重量)?？梢匀魏涡问皆陲暳现屑尤氲鞍酌福龅鞍酌甘窍鄬^純的蛋白酶，或者與欲添加至動物飼料中的其它成分相混合，即為動物飼料添加劑的形式，如所謂的動物飼料預(yù)混物。動物飼料添加劑除了酸-穩(wěn)定性蛋白酶外，本發(fā)明的動物飼料添加劑還含有至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物質(zhì)，和/或至少一種宏量礦物質(zhì)。另外，任選的飼料-添加劑成分有生色劑，芳香化合物，穩(wěn)定劑和/或至少一種選自下列的其它酶植酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC3.2.1.8；半乳聚糖酶EC3.2.1.89；和/或β-葡聚糖酶EC3.2.1.4(EC指的是源自NC-IUBMB的酶名稱1992版，1992)，也可參見環(huán)球網(wǎng)(www)，網(wǎng)址為http∥www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。在特定的實施方案中，明確限定了這些其它酶(如同上文對蛋白酶制品所作的限定和舉例那樣，參見實施例8)。通常，脂溶性和水溶性維生素以及痕量礦物質(zhì)形成所謂的欲添加至飼料中的預(yù)混物的一部分，而宏量礦物質(zhì)通常被單獨加入到飼料中。當(dāng)加入本發(fā)明的酸-穩(wěn)定性蛋白酶時，這些組合物類型中的任一種都是本發(fā)明的動物飼料添加劑。在特定的實施方案中，動物的食物或飼料中欲包含(或按規(guī)定必須包含)本發(fā)明的動物飼料添加劑，所述添加劑的水平為0.01-10.0％；更特別地為0.05-5.0％；或0.2-1.0％(％指的是每100克飼料中添加劑的克數(shù))。預(yù)混物中更是如此。因此，通過將相同成分在飼料中的終濃度分別乘以10-10000；20-2000；或100-500(指的是上述3個百分比包含的區(qū)間)，即可得出動物飼料添加劑，如預(yù)混物中各個成分的濃度。下表A中顯示了各個飼料成分和飼料添加劑成分合乎需要的終濃度，即在飼料中的濃度。以下是這些成分實例非-排他性的列表脂溶性維生素的例子有維生素A，維生素D3，維生素E和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的例子有維生素B12，生物素和膽堿，維生素B1，維生素B2，維生素B6，煙酸，葉酸和泛酸鹽，如D-泛酸鈣。痕量礦物質(zhì)的例子有錳，鋅，鐵，銅，碘，硒和鈷。宏量礦物質(zhì)的例子有鈣，磷和鈉。下表A中列出了對這些成分的營養(yǎng)需求-以家禽和小豬/豬舉例。營養(yǎng)需求指的是應(yīng)該在食物中提供所示濃度的這些成分。這些數(shù)據(jù)匯編自NRC，豬的營養(yǎng)需求，第9次修訂版，1988，國立研究委員會農(nóng)業(yè)部動物營養(yǎng)學(xué)委員會豬營養(yǎng)學(xué)小組委員會。NationalAcademyPress，Washington，D.C.1988；和NRC，家禽的營養(yǎng)需求，第9次修訂版，1994，國立研究委員會農(nóng)業(yè)部動物營養(yǎng)學(xué)委員會家禽營養(yǎng)學(xué)小組委員會。NationalAcademyPress，Washington，D.C.1994。在可替換的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料添加劑含有至少一種表A中特指的單個成分。至少一種指的是一種，或兩種，或三種，或四種，依此類推直至所有13種，或所有15種單個成分中的一種或多種。更具體地，在本發(fā)明的添加劑中包含至少一種單個成分，所述成分的量能使其在飼料中的濃度處于表A第4欄，或第5欄，或第6欄所示的范圍之內(nèi)。如上文所解釋的，通過將這些范圍的區(qū)限乘以10-10000；20-2000；或100-500，即可得出相應(yīng)的飼料添加劑的濃度。例如，考慮到維生素A的預(yù)混含量對應(yīng)于10-10000IU/kg的飼料-含量，此運算會產(chǎn)生下列區(qū)間100-108IU；或200-2×107IU；或1000-5×106IU/kg添加劑。表A營養(yǎng)需求-和優(yōu)選范圍動物飼料組合物動物飼料組合物或食物具有相對較高的蛋白質(zhì)含量。根據(jù)上文所述的國立研究委員會(NRC)出版物，家禽和豬的食物具有下表B第2-3欄所示的特征。魚食具有表B第4欄所示的特征。另外，這種魚食通常具有的粗脂肪含量為200-310g/kg。以鮭魚食舉例說明這些魚食，所述魚食是在Aquaculture，principlesandpractices，T.VR.Pillay編，BlackwellScientificPublicationsLtd.1990；Fishnutrition，第2版，JohnE.Halver編，AcademicPressInc.1989的基礎(chǔ)上設(shè)計的。本發(fā)明的動物飼料組合物的粗蛋白含量為50-800g/kg，另外還含有至少一種本文所要求的蛋白酶。另外，或者在(上述粗蛋白含量的)替代實施方案中，本發(fā)明動物飼料組合物所具有的可代謝能量的含量為10-30MJ/kg；和/或鈣含量為0.1-200g/kg；和/或可利用的磷的含量為0.1-200g/kg；和/或甲硫氨酸的含量為0.1-100g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸的含量為0.1-150g/kg；和/或賴氨酸的含量為0.5-50g/kg。在特定的實施方案中，可代謝能量，粗蛋白，鈣，磷，甲硫氨酸，甲硫氨酸加半胱氨酸，和/或賴氨酸的含量在下表B的范圍2，3，4或5(R.2-5)的任一個之內(nèi)。如AnimalNutrition，第4版，第13章(P.McDonald，R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh編，LongmanScientificandTechnical，1988，ISBN0-582-40903-9)所述，粗蛋白被計算為氮(N)乘以系數(shù)6.25，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通過Kjeldahl法(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists，WashingtonDC)測定氮含量?？稍贜RC出版物NutrientRequirementsofSwine(1988)pp.2-6和EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs，Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension，7361DABeekbergen，TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5的基礎(chǔ)上計算出可代謝的能量?？稍陲暳媳淼幕A(chǔ)上計算出全部的動物食物中鈣，可利用的磷和氨基酸的食物含量，所述飼料表如Veevoedertable1997，gegevensoverchemischesamenstelling，verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7。在特定的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料組合物含有至少一種如上文所定義的植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料組合物含有0-80％玉米；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麥；和/或0-70％大麥；和/或0-30％燕麥；和/或0-40％豆粉；和/或0-10％魚粉；和/或0-20％乳清。例如，可將動物食物制備成搗碎的飼料(非-粒狀)或粒狀飼料。一般將磨碎的飼料相混合，再根據(jù)所需類別的詳細(xì)說明添加足夠量的必需維生素和礦物質(zhì)。加入固體或液體酶制劑。例如，一般在混合步驟之前或之中加入固體酶制劑；一般在成粒步驟之后加入液體酶制品。也可以將酶摻入飼料添加劑或預(yù)混物中。食物中最終的酶濃度范圍為0.01-200mg酶蛋白質(zhì)/kg食物，例如5-30mg酶蛋白質(zhì)/kg動物食物。實施例7中顯示了動物飼料組合物的例子。表B動物食物中能量，蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)的數(shù)值范圍在本發(fā)明處理植物蛋白質(zhì)的方法的特定實施方案中，還包括另一個步驟，即加入植酸酶。在另一個特定的實施方案中，除了聯(lián)合使用植酸酶和蛋白酶進行處理以外，也可以加入其它酶，其中這些酶選自含有其它蛋白酶，植酸酶，脂解酶和葡糖苷酶/糖酶的組。WO95/28850中描述了這些酶的例子。當(dāng)然，應(yīng)該使用有效量的蛋白酶，即所述量足以改善飼料的溶解性和/或改善飼料的營養(yǎng)價值。目前，希望以下列的一種或多種量(劑量范圍)使用酶0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10，所有這些范圍皆為每kg飼料中蛋白酶的mg數(shù)(ppm)。為了測定每kg飼料中蛋白酶的mg數(shù)，從飼料組合物中純化出蛋白酶，使用相關(guān)測定法(參見蛋白酶活性，底物和測定法一節(jié))測定純化蛋白酶的比活。也使用相同的測定法測定所述飼料組合物的蛋白酶活性，在這兩個測定結(jié)果的基礎(chǔ)上，計算出以每kg飼料中所含蛋白酶的mg數(shù)計的劑量。使用相同的原理測定飼料添加劑中蛋白酶的mg數(shù)。當(dāng)然，如果可獲得制備飼料添加劑或飼料所用的蛋白酶樣品，可測定該樣品的比活(而不必從飼料組合物或添加劑中純化蛋白酶)。很多植物含有抗-營養(yǎng)因子，如凝集素和胰蛋白酶抑制劑。最重要的大豆抗-營養(yǎng)因子是凝集素大豆凝集素(SBA)和大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)。凝集素是以相當(dāng)強的特異性與特定的含糖分子結(jié)合的蛋白質(zhì)，當(dāng)其被消化時，可與小腸上皮結(jié)合。這可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞的存活力下降，從而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的吸收減少。SBA是糖基化的四聚體凝集素，其亞單位的分子量約為30kDa，并對N-乙酰半乳糖胺具有高親和力。胰蛋白酶抑制劑影響小腸蛋白酶解，降低其消化蛋白質(zhì)的能力，也會使胰腺分泌的消化酶增加，導(dǎo)致以消化酶的形式損失氨基酸。胰蛋白酶抑制劑的例子有Bowman-Birk抑制劑，其分子量約為8kDa，含有7個二硫鍵，并具有兩個特異于胰蛋白酶-樣和胰凝乳蛋白酶-樣蛋白酶的抑制性環(huán)。其它例子有所謂Kunitz抑制劑因子(例如大豆Kunitz胰蛋白酶抑制劑，其含有一個胰蛋白酶-樣蛋白酶的結(jié)合位點，分子量約為20kDa)。已證實本發(fā)明所用的蛋白酶可以水解抗-營養(yǎng)因子，如SBA凝集素，胰蛋白酶抑制劑BowmanBirk抑制劑和大豆Kunitz因子。參見實施例5的實驗部分。因此，本發(fā)明還涉及酸-穩(wěn)定性蛋白酶水解，或減少抗-營養(yǎng)因子的量的用途，所述抗-營養(yǎng)因子如SBA凝集素和胰蛋白酶抑制劑，如BowmanBirk抑制劑和Kumitz因子，如大豆Kunitz因子。實施例1篩選酸-穩(wěn)定性蛋白酶分析多種蛋白酶在pH3時的穩(wěn)定性，目的是鑒定出具有必要的穩(wěn)定性，從而能流經(jīng)單胃動物酸性胃的蛋白酶。通過常規(guī)的層析法，如離子交換層析，疏水作用層析和大小排阻層析(參見例如ProteinPurification，Principles，HighResolutionMethods，andApplications，Jan-ChristerJanson，LarsRyden編，VCHPublishers，1989)純化蛋白酶。按下述測定蛋白酶活性于25℃，pH9.5中將蛋白酶與1.67％Hammarsten酪蛋白保溫30分鐘，然后加入TCA(三氯醋酸)至終濃度為2％(w/w)，過濾混合物以除去沉淀物，分析濾液的游離一級氨基(在基于OPA(鄰苯二醛)的比色試驗中，通過使用絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，測定340nm處的光吸收值來進行檢測(BiochemischeTaschenbuchteiilII，Springer-Verlag(1964)，p.93和p.102))。一個酪蛋白蛋白酶單位(CPU)被定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下，即25℃和pH9.5，每分鐘釋放1mmolTCA-可溶性一級氨基所需酶的量。用水將蛋白酶稀釋至活性為0.6CPU/l，分成兩等份，然后分別用100mM檸檬酸鹽緩沖液，pH3和100mM磷酸鹽緩沖液，pH7將每等份進一步稀釋至0.3CPU/l。將稀釋的樣品置于37℃保溫1小時，將20μl樣品上樣于含有1％脫脂奶的1％瓊脂糖平板的孔中。37℃保溫平板(pH7.0)過夜，測量清亮的區(qū)域。在此試驗中，多種蛋白酶表現(xiàn)較好，目前已鑒定出下列兩種蛋白酶實施例2中描述的Nocardiopsisalba和擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶。根據(jù)有關(guān)用于專利程序的微生物保藏的國際認(rèn)可的布達(dá)佩斯條約，按下述將Nocardiopsisalba菌株保藏于德國的DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，MascheroderWeglb，D-38124BraunSchweig保藏日2001年1月22日保藏號NocardiopsisalbaDSM14010由NovozymesA/S進行保藏，后來轉(zhuǎn)讓給了Hoffmann-LaRocheAG。實施例2擬諾卡氏菌屬蛋白酶的制備，鑒定和比較研究發(fā)酵從胰蛋白胨酵母瓊脂平板中將Nocardiopsisalba接種于燒瓶中，所述燒瓶各含有100ml具有下列組成的HG-23培養(yǎng)基燕麥粉45g/l，酵母提取物2g/l，磷酸氫二鈉12g/l，磷酸二氫鉀6g/l，PluronicPE61000.2ml/l，溶于蒸餾水。37℃發(fā)酵該菌株9天。純化在1升燒杯中，以10000×g將培養(yǎng)液離心30分鐘?；旌仙锨逡?，通過流經(jīng)SeitzK-250縱深濾板(depthfilterplate)進行過濾以進一步澄清上清液。通過在截留分子量為3kDa的聚醚砜盒(Filtron)上進行超濾以濃縮已澄清的濾液。將濃縮的酶轉(zhuǎn)移至G25Sephadex柱(AmershamPharmaciaBiotech)上的50mMH3BO3，5mM3，3′-二甲基戊二酸，1mMCaCl2，pH7(緩沖液A)中，并上樣于已用緩沖液A平衡的Bacitracin瓊脂糖柱(UpfrontChromatographyA/S)。用緩沖液A清洗Bacitracin柱以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后使用添加有25％2-丙醇和1M氯化鈉的緩沖液A從柱上洗脫蛋白酶。集中具有蛋白酶活性的級分，通過在G25Sephadex柱(AmershamPharmaciaBiotech)上層析，將級分轉(zhuǎn)移至20mMCH3COOH/NaOH，1mMCaCl2，pH4.5(緩沖液B)中。將緩沖液交換的蛋白酶收集物上樣于已用緩沖液B平衡的SOURCE30S柱(AmershamPharmaciaBiotech)。用緩沖液B清洗SOURCE30S柱，然后用緩沖液B中線性遞增的NaCl梯度(0至0.25M)洗脫蛋白酶。檢測柱級分的蛋白酶活性，通過SDS-PAGE分析含蛋白酶的級分。集中純的級分，用于進一步鑒定。按上文針對擬諾卡氏菌屬蛋白酶的一般性描述，使用常規(guī)方法制備擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶。鑒定已發(fā)現(xiàn)得自Nocardiopsisalba的蛋白酶的分子量為Mr＝21kDa(SDS-PAGE)，并測出下列部分(N-末端(MVS))氨基酸序列ADIIGGLAYTMGGRCSV(SEQIDNO2)。得自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶具有以下188個氨基酸的序列ADIIGGLAYTMGGRCSVGFAATNAAGQPGFVTAGHCGRVGTQVTIGNGRGVFEQSVFPGNDAAFVRGTSNFTLTNLVSRYNTGGYAAVAGHNQAPIGSSVCRSGSTTGWHCGTIQARGQSVSYPEGTVTNMTRTTVCAEPGDSGGSYISGTQAQGVTSGGSGNCRTGGTTFYQEVTPMVNSWGVRLRT(SEQIDNO1)。鑒定的目的是研究它們相對于Sub.Novo，Sub.Novo(Y217L)和SAVINASETM而言的pH-穩(wěn)定性，pH-活性和溫度-活性分布圖。Sub.Novo是得自解淀粉芽孢桿菌的枯草蛋白酶，而Sub.Novo(Y217L)是其突變體，該突變體公開于WO96/05739中。使用常規(guī)方法從野生型菌株的培養(yǎng)物中制備和純化Sub.Novo，并按照EP130756的實施例1-2和15-16所述制備突變體。SAVINASETM是得自克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)(以前是遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)NCIB10309)的枯草蛋白酶，可購自丹麥，NovozymesA/S，Krogshoejvej，DK-2880Bagsvaerd。美國專利號3723250中描述了它的制備。實施例2A測定蛋白酶樣品的SDS-PAGE純度通過下列方法測定蛋白酶樣品的SDS-PAGE純度在置于冰上的Eppendorf管中混合40μl蛋白酶溶液(A280濃度＝0.025)與10μl50％(w/v)TCA(三氯醋酸)。在冰上放置半小時之后，離心Eppendorf管(5分鐘，0℃，14,000×g)，小心取出上清液。在沉淀中加入20μlSDS-PAGE樣品緩沖液(200μlTris-甘氨酸SDS樣品緩沖液(2×)(125mMTris/HCl，pH6.8，4％(w/v)SDS，50ppm溴酚藍(lán)，20％(v/v)甘油，得自NOVEXTM的LC2676)+160μl蒸餾水+20μlβ-巰基乙醇+20μl3M未緩沖的TrisBase(SigmaT-1503))，將管煮沸3分鐘。短暫離心Eppendorf管，將10μl樣品上樣于得自NOVEXTM的4-20％梯度Tris-甘氨酸預(yù)制凝膠(基于Laemmli化學(xué)的聚丙烯酰胺梯度凝膠，但凝膠中不含SDS(Laemmli，U.K.，(1970)自然，vol.227，pp.680-685)，EC60255)。在兩種緩沖液的槽中，用Tris-甘氨酸電泳緩沖液(2.9gTrisBase，14.4g甘氨酸，1.0gSDS，加蒸餾水至1升)，以150V的恒定電壓進行電泳，直至溴酚藍(lán)示蹤染料到達(dá)凝膠的底部。電泳之后，通過緩慢振蕩，用100ml蒸餾水將凝膠浸洗3次，每次5分鐘。然后用Gelcode_BlueStainReagent(得自PIERCE的膠狀ComassieG-250產(chǎn)品，PIERCE目錄號為24592)緩慢振蕩凝膠1小時，再用蒸餾水緩慢振蕩清洗8至16小時，其間更換幾次蒸餾水。最后，在兩片玻璃紙之間干燥凝膠。用裝配有Fotolook95v2.08軟件，得自AGFA的ArcusII掃描儀掃描干燥的凝膠，并通過具有下列(Fotolook95v2.08)設(shè)置的File/Acquire命令，將掃描圖像引入Windows介面下的圖像評價軟件CREAMTM(目錄號990001和990005，Kem-En-Tec，丹麥)Original＝Reflective，Mode＝ColorRGB，Scanresolution＝240ppi，Outputresolution＝1201pi，Scalefactor＝100％，Range＝HistogramwithGlobalselection和Min＝0和Max＝215，ToneCurve＝None，Sharpness＝None，Descreen＝None和Flavor＝None，從而產(chǎn)生SDS-PAGE凝膠的*.img圖形文件，用于在CREAMTM中進行評價。用菜單命令A(yù)nalysis/l-D評價*.img圖形文件。用LanePlaceTool將兩條掃描線置于*.img圖形文件上一條為樣品掃描線，一條為背景掃描線。將樣品掃描線置于自上樣狹槽最下方至溴酚藍(lán)示蹤染料位置最上方的樣品泳道(含所述蛋白酶)的中間。將背景掃描線置于與樣品掃描線平行的位置，但此位置是圖形化的SDS-PAGE凝膠上沒有上樣樣品的位置，背景掃描線的起點和終點垂直于樣品掃描線的起點和終點。背景掃描線代表真實的凝膠背景。掃描線的寬度和外形未經(jīng)調(diào)節(jié)。用具有中度敏感性的l-D/Scan菜單命令紀(jì)錄沿著掃描線的強度。使用l-D/Editor菜單命令，從樣品掃描中扣除背景掃描。然后選擇l-D/Results菜單命令，將通過CREAMTM軟件計算出的蛋白酶峰面積的百分比用作蛋白酶的SDS-PAGE純度。所有蛋白酶樣品都具有大于95％的SDS-PAGE純度。實施例2BpH-活性試驗使用Suc-AAPF-pNA(Sigma_S-7388)獲得pH-活性分布圖。試驗緩沖液100mM琥珀酸(Merck1.00682)，100mMHEPES(SigmaH-3375)，100mMCHES(SigmaC-2885)，100mMCABS(C-5580)，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH值為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。試驗溫度25℃。在各個pH值下，將300μl蛋白酶樣品(用0.01％Triton_X-100稀釋)與1.5ml試驗緩沖液混合，使混合物的pH達(dá)到試驗緩沖液的pH。通過加入1.5mlpNA底物(50mg溶解于1.0mlDMSO中，再用0.01％Triton_X-100稀釋45倍)以開始反應(yīng)，混合之后，用分光光度計監(jiān)測A450的增加，作為在所述pH下蛋白酶活性的測量結(jié)果。用其它pH值的試驗緩沖液重復(fù)進行試驗，將活性的測量結(jié)果作圖為針對pH的相對活性。用最高活性(pH-最適值)使相對活性歸一化，即將pH-最適值下的活性設(shè)置為1，或100％。稀釋蛋白酶樣品以確保所有的活性測量結(jié)果都能落入該試驗的劑量-反應(yīng)曲線的線性部分。實施例2CpH-穩(wěn)定性試驗使用Suc-AAPF-pNA(Sigma_S-7388)獲得pH-穩(wěn)定性分布圖。試驗緩沖液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH值為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。用各個受試pH值下的試驗緩沖液稀釋各個蛋白酶樣品(溶于1mM琥珀酸，2mMCaCl2，100mMNaCl，pH6.0，A280光吸收值＞10)至A280＝1.0。于37℃將經(jīng)稀釋的蛋白酶樣品保溫2小時。保溫之后，用100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH9.0稀釋蛋白酶樣品，使所有樣品的pH為pH9.0。在以下的活性測定中，溫度為25℃。將300μl經(jīng)稀釋的蛋白酶樣品與1.5mlpH9.0試驗緩沖液混合。通過加入1.5mlpNA底物(50mg溶解于1.0mlDMSO中，再用0.01％Triton_X-100稀釋45倍)以開始活性反應(yīng)，混合之后，用分光光度計監(jiān)測A450的增加，作為(殘留)蛋白酶活性的測量結(jié)果。在不同pH-值下進行37℃保溫，將活性的測量結(jié)果作圖為針對pH的殘留活性。用平行保溫的活性(對照)使殘留活性歸一化，其中在測定活性之前用pH9.0的試驗緩沖液將蛋白酶稀釋至A280＝1.0，5℃保溫2小時以作為其它的保溫。在測定活性之前稀釋蛋白酶樣品，以確保所有的活性測量結(jié)果都能落入該試驗的劑量-反應(yīng)曲線的線性部分。實施例2D溫度-活性試驗使用ProtazymeAK片劑獲得溫度分布圖。ProtazymeAK片劑是由Megazyme制備成片劑的經(jīng)天青精染色的交聯(lián)酪蛋白。試驗緩沖液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用NaOH調(diào)節(jié)至pH值為9.0。通過緩慢攪拌將ProtazymeAK片劑懸浮于2.0ml0.01％Triton_X-100。在Eppendorf管中混合500μl該懸浮液和500μl試驗緩沖液，將管置于冰上。加入20μl蛋白酶樣品(用0.01％Triton_X-100稀釋)。通過將Eppendorf管轉(zhuǎn)移至設(shè)置為檢測溫度的Eppendorf熱混合儀來啟動試驗。在處于最高振蕩速率的Eppendorf熱混合儀上將管保溫15分鐘。通過將管移回冰浴以終止試驗性保溫。在冰冷的離心機中將管離心幾分鐘，用分光光度計讀出上清液的A650。在此試驗中包括空白緩沖液(替代酶)。A650(蛋白酶)-A650(空白)為蛋白酶活性的測量結(jié)果。在不同溫度下進行試驗，將活性的測量結(jié)果作圖為針對保溫溫度的相對活性。用最高活性(溫度最適值)使相對活性歸一化。稀釋蛋白酶樣品，以確保所有的活性測量結(jié)果都能落入該試驗的劑量-反應(yīng)曲線的接近線性部分。表1為活性最適值(pH-和溫度活性)的一覽表。圖1-3為pH-穩(wěn)定性，pH-活性和溫度-活性的分布圖，表2為蛋白酶在酸性pH-值下的pH-穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的詳細(xì)比較。表1多種蛋白酶的pH-和溫度最適值表2多種蛋白酶在pH2.0至5.0之間的pH-穩(wěn)定性實施例2E純化的蛋白酶樣品的光吸收純度測定A280/A260比率按下述測定純化的蛋白酶樣品的A280/A260比率。A260指的是在光程長度為1cm的樣品池中，蛋白酶樣品在260mm下相對于緩沖液空白的光吸收值。A280指的是在光程長度為1cm的樣品池中，相同蛋白酶樣品在280mm下相對于緩沖液空白的光吸收值。用緩沖液稀釋實施例2中所得的純化蛋白酶樣品，直至分光光度計的A280讀數(shù)落入其反應(yīng)曲線的線性部分。由讀數(shù)測定A280/A260比率對于擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262而言為1.83，對于Nocardiopsisalba而言為1.75。實施例3得自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶降解大豆粉(SBM)不溶性部分的能力檢測得自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶使SBM的不溶性/不能被消化的部分靠近消化酶和/或添加的外源性酶的能力。將該蛋白酶的性能與兩種按照WO95/02044所述制備的天冬氨酸蛋白酶，ProteaseI和ProteaseII相比較。所述文獻(xiàn)還公開了這兩種酶在飼料中的用途。ProteaseI是II型曲霉胃蛋白酶(Aspergillopepsin)類蛋白酶，ProteaseII是I型曲霉胃蛋白酶類蛋白酶(它們都是天冬氨酸蛋白酶，即非-枯草蛋白酶類的蛋白酶)，它們皆得自Aspergillusaculeatus(參見上文所述的HandbookofProteolyticEnzymes)。在模擬單胃動物消化道(包括在pH2時用胃蛋白酶處理，在pH7時用胰酶制劑處理)的過程中產(chǎn)生了受試底物，即所謂的豆粉殘留物。在用胰酶制劑處理的步驟中，加入了一系列高劑量的商品酶，以降解可靠近現(xiàn)存商品酶的SBM成分。加入以下皆可購自丹麥，NovozymesA/S的酶ALCALASETM2.4L，NEUTRASETM0.5L，F(xiàn)LAVOURZYMETM1000L，ENERGEXTML，BIOFEEDTMPlusL，PHYTASENOVOTML。所用SBM是粒狀的飼料用標(biāo)準(zhǔn)48％蛋白質(zhì)SBM。處理后，所得豆粉殘留物中僅剩下5％的總蛋白質(zhì)。FITC標(biāo)記方法隨后，按下述用FITC(MolecularProbes，F(xiàn)-143)標(biāo)記殘留物將豆粉殘留物(濕重為25g，干重約為5g)懸浮于100ml0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9中，40℃攪拌1小時。使懸浮液冷卻至室溫，黑暗中用5-異硫氰酸熒光素(FITC)處理過夜。通過超濾(截留分子量為10,000)除去未結(jié)合的探針。FITC-試驗使用下列測定法，用經(jīng)FITC標(biāo)記的豆粉殘留物檢測蛋白酶降解豆粉殘留物的能力于37℃混合0.4ml蛋白酶樣品(A280＝0.1)與0.4mlFITC-豆粉殘留物(0.2M磷酸鈉緩沖液pH6.5中的10mg/ml懸浮液)，在0小時之后，和保溫22小時之后測定相對熒光單位(RFU485/535nm；激發(fā)/監(jiān)測波長)。測定RFU之前，以20,000×g離心樣品1分鐘，將250微升上清液轉(zhuǎn)移至黑色的微滴盤中。使用VICTOR1420Multilabel計數(shù)器(體外，丹麥)進行測定。RFU的-般性描述可參見IainD.Johnson，IntroductiontoFluorescenceTechniques，HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals，MolecularProbes，RichardP.Haugland，第6版，1996(ISBN0-9652240-0-7)。通過加入0.4ml緩沖液替代酶樣品來制備空白對照樣品。RFU樣品＝ΔRFU樣品-ΔRFU空白對照，其中ΔRFU＝RFU(22小時)-RFU(0小時)所得FITC值(RFU樣品值)示于下表3。FITC值的誤差容限一般為+/-20,000。與ProteaseI和ProteaseII形成對照的是，得自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶能顯著降解豆粉殘留物。表3蛋白酶降解豆粉殘留物的能力實施例4體外檢測得自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶在體外消化系統(tǒng)(模擬單胃動物的消化)中檢測以下蛋白酶溶解玉米-SBM(玉米-豆粉)蛋白質(zhì)的能力，所述蛋白酶是得自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶，以及得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶(“PD498”，按WO93/24623的實施例1所述制備)，和得自米曲霉的含蛋白酶酶制品FLAVOURZYMETM(可購自丹麥的NovozymesA/S，Bagsvaerd)。在缺乏外源性蛋白酶時保溫玉米-SBM以用作空白對照。體外模型概況底物使用10g玉米-SBM食物，其中玉米-SBM的比例為6∶4(w/w)。SBM中的蛋白質(zhì)含量為43％(w/w)，玉米粉中的蛋白質(zhì)含量為8.2％(w/w)。10g玉米-SBM食物中的蛋白質(zhì)總量為2.21g。消化酶胃蛋白酶(SigmaP-7000；539U/mg，固體)，胰酶制劑(SigmaP-7545；8xU.S.P.(USPharmacopeia))。酶蛋白質(zhì)的測定使用S.C.Gill&P.H.vonHippel，AnalyticalBiochemistry182，319-326(1989)概述的原理，基于A280值和氨基酸序列(氨基酸組成)計算蛋白酶酶蛋白質(zhì)的量。體外模型的實驗方法1.稱取10g底物置于100ml燒瓶中。2.于0分鐘，在燒瓶中邊混合邊加入46ml含胃蛋白酶(3000U/g食物)的HCl(0.1M)和1ml蛋白酶(0.1mg酶蛋白質(zhì)/g食物，只有FLAVOURZYMETM例外3.3mg/g食物)。將燒瓶置于40℃下保溫。3.于20-25分鐘，測定pH。4.于45分鐘，加入16mlH2O。5.于60分鐘，加入7mlNaOH(0.4M)。6.于80分鐘，加入5ml含胰酶制劑(8.0mg/g食物)的NaHCO3(1M)。7.于90分鐘，測定pH。8.于300分鐘，測定pH。9.于320分鐘，取出30ml等分試樣離心(10000×g，10分鐘，0℃)。10.測定上清液中總的可溶性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的測定使用Kjeldahl法(測定氮的百分比；A.O.A.C.(1984)，OfficialMethodsofAnalysis，第14版，AssociationofOfficialAnalyticalCheimists，WashingtonDC)分析上清液的蛋白質(zhì)含量。計算使用下列等式計算所有樣品的體外蛋白質(zhì)溶解性。食物樣品的蛋白質(zhì)量10g的22.1％＝2.21g如果所有蛋白質(zhì)都溶解于75ml液體，則上清液的蛋白質(zhì)濃度為2.21g/75ml≈2.95％。應(yīng)說明的是上清液還包括消化酶和外源性酶。為了測定溶解性，可能的話，應(yīng)從上清液的蛋白質(zhì)濃度中減去消化酶和外源性酶貢獻(xiàn)出的蛋白質(zhì)。胰酶制劑(Xmg/g食物)和胃蛋白酶(YU/g食物)中的蛋白質(zhì)百分比＝((Xmg胰酶制劑/g食物×10g食物×0.69×100％)/(1000mg/g×75g))+((YU胃蛋白酶/g食物×10g食物×0.57×100％)/(539U/mg×1000mg/g×75g))，其中0.69和0.57指的是所用胰酶制劑和胃蛋白酶制品的蛋白質(zhì)含量(即經(jīng)上述Kjeldahl法測定，69％的胰酶制劑和57％的胃蛋白酶是蛋白質(zhì))。外源性酶的蛋白質(zhì)百分比(ZmgEP/g食物)＝(ZmgEP/g食物×10g食物×100％)/(1000mg/g×75g)校正后上清液的蛋白質(zhì)百分比＝分析得到的上清液蛋白質(zhì)百分比-(消化酶的蛋白質(zhì)百分比+外源性酶的蛋白質(zhì)百分比)蛋白質(zhì)的溶解性(％)＝(校正后上清液的蛋白質(zhì)百分比×100％)/2.95％下面的結(jié)果表明得自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶對蛋白質(zhì)的溶解性顯著好于空白對照以及芽孢桿菌屬菌種NCJMB40484的蛋白酶。a，b，c上表第2欄中上標(biāo)字母不相同的值顯著不同，P＜0.05。SD是標(biāo)準(zhǔn)差；n是觀察的例數(shù)。實施例5降解凝集素SBA和大豆Bowman-Birk及Kunitz抑制劑檢測得自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262和芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶水解大豆凝集素(SBA)和大豆Bowman-Birk及Kunitz胰蛋白酶抑制劑的能力。于37℃，pH6.5中將純的SBA(Fluka61763)，Bowman-Birk抑制劑(SigmaT-9777)或Kunitz抑制劑(大豆胰蛋白酶抑制劑，BoehringerMannheim109886)與蛋白酶保溫2小時(蛋白酶∶抗-營養(yǎng)因子＝1∶10，基于A280)。保溫緩沖液50mM二甲基戊二酸，150mMNaCl，1mMCaCl2，0.01％TritonX-100，pH6.5。由SDS-PAGE凝膠上本來有的SBA或胰蛋白酶抑制劑帶的消失，和低分子量降解產(chǎn)物的出現(xiàn)估計蛋白酶降解SBA和蛋白酶抑制劑的能力。用考馬斯藍(lán)染色凝膠，通過掃描測定帶的強度。下表4顯示了結(jié)果，即所降解的抗-營養(yǎng)因子的百分比。也期望在保溫豆粉與候選蛋白酶之后，能應(yīng)用Westem技術(shù)，用抗SBA，Bowman-Birk抑制劑或Kunitz抑制劑的抗體估計蛋白酶降解大豆中的抗-營養(yǎng)因子的能力(參見WO98/56260)。表4實施例6酸-穩(wěn)定性擬諾卡氏菌屬蛋白酶對適于烤焙的小雞的生長性能的作用根據(jù)法國官方指導(dǎo)活動物實驗的說明進行試驗。性別分離的一日齡小雞(“RossPM3”)由商業(yè)孵化所提供。將小雞圈養(yǎng)在用鐵絲網(wǎng)作地面的多層雞籠中，這些雞籠被置于環(huán)境受控的室內(nèi)。隨意供給飼料和自來水。第8天，按體重將小雞分組，6只小雞為一組，對它們進行對照處理，即接受不含酶的實驗食物，或酶處理，即接受每kg飼料添加含100mg酶蛋白質(zhì)的蛋白酶的實驗食物。用12組重復(fù)每種處理，每個性別6組。在第8和29天給各組稱重。測定中間期(intermediateperiod)的飼料消耗，計算體重增加量和飼料轉(zhuǎn)化率。實驗食物基于以玉米淀粉和豆粉(44％粗蛋白)為主要成分(表5)。在約70℃使飼料成為粒狀(壓模形狀3×20mm)。以固定量的水稀釋適當(dāng)量的蛋白酶，噴灑在粒狀的飼料上。對對照處理而言，用相同的方式使用足夠量的水進行處理。為了進行統(tǒng)計學(xué)評價，使用SAS包(SASInstituteInc.，1985)中的GLM程序進行方差的雙因子分析(因子處理和性別)。當(dāng)表現(xiàn)出顯著的處理效果(p＜0.05)時，用Duncan試驗分析處理方式之間的差異。預(yù)期可獲得改良的體重增加，和/或改良的飼料轉(zhuǎn)化率，和/或改良的豆粉營養(yǎng)價值(考慮到玉米淀粉是很容易消化的成分)。參考文獻(xiàn)EEC(1986)DirectivedelaCommissiondu9avril1986fixantlam殫hodedecalculdelavaleurénérgetiquedesalimentscomposésdestinslavolaille.JournalOfficieldesCommunautésEuropéennes，L130，53-54。SASInstituteInc.(1985)SAS_User’sGuide，Version5Edition.CaryNC。表5實驗食物的組成1所分析的含量90.6％干物質(zhì)，45.3％粗蛋白，2.0％粗脂肪，4.9粗纖維2相當(dāng)于90mg拉沙里菌素-Na/kg飼料作為抗球蟲劑(anticoccidial)3基于所分析的營養(yǎng)物質(zhì)的含量進行計算(EC-等式；EEC，1986)飼料成分的供貨商玉米淀粉法國RoquettesFrères，F(xiàn)-62136Lestrem豆粉44德國RekasanGmbH，D-07338Kaulsdorf動物脂法國FondoirsGachotSA，F(xiàn)-67100Strasbourg豆油法國EwocoSarl，F(xiàn)-68970GuemarDL-甲硫氨酸法國ProduitRocheSA，F(xiàn)-92521Neuilly-sur-SeineMCP法國BrenntagLorraine，F(xiàn)-54200Toul鹽法國MinoterieModeme，F(xiàn)-68560Hirsingue結(jié)合劑法國MinoterieModeme，F(xiàn)-68560Hirsingue預(yù)混物(AMvolchairNS4231)法國Agrobase，F(xiàn)-01007Bourg-en-BresseAvatec法國ProduitRocheSA，F(xiàn)-92521Neuilly-sur-Seine實施例7用于火雞和屬于鮭科的魚的，添加有酸-穩(wěn)定性擬諾卡氏菌屬蛋白酶的預(yù)混物和食物制備具有下列組成的預(yù)混物(每千克的含量)5000000IE維生素A1000000IE維生素D313333mg維生素E1000mg維生素K3750mg維生素B12500mg維生素B21500mg維生素B67666mg維生素B1212333mg煙酸33333mg生物素300mg葉酸3000mgD-泛酸鈣1666mgCu16666mgFe16666mgZn23333mgMn133mgCo66mgI66mgSe5.8％鈣在此預(yù)混物中加入得自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶(按實施例2所述制備)，加入量相當(dāng)于10g蛋白酶酶蛋白質(zhì)/kg。按下述制備粒狀火雞起始和飼養(yǎng)食物，所述食物具有下表所示的組成(基于Leeson和Summers，1997，但通過使用最優(yōu)化程序AGROSOFT_重新計算過，不含肉粉)，且每kg含100mg蛋白酶酶蛋白質(zhì)在級聯(lián)混合器中混合磨碎的玉米，豆粉，魚粉和植物油。以10g/kg食物的量加入石灰石，磷酸鈣和鹽，以及上述預(yù)混物，接著進行混合。將所得混合物制成粒狀(用蒸汽調(diào)節(jié)，然后進行成粒步驟)。也按上文的一般性概述制備鮭魚的兩種食物。實際的組成示于下表(匯編自Refstie等(1998)，Aquaculture，vol.162，p.301-302)。通過使用Agrosoft_飼料最優(yōu)化程序重新計算估計的營養(yǎng)物質(zhì)含量。在食物中加入按實施例2所述制備的得自Nocardiopsisalba的蛋白酶，加入的量相當(dāng)于每kg食物100mg蛋白酶酶蛋白質(zhì)。實施例8測定含蛋白酶的酶產(chǎn)品的純度可通過基于含蛋白酶的酶產(chǎn)品在大小排阻層析柱上的分級分離的方法，測定含蛋白酶的酶產(chǎn)品，例如商購的多-組分酶產(chǎn)品之類的蛋白酶制品的純度。大小-排阻層析也被稱為凝膠過濾層析，它基于多孔的凝膠基質(zhì)(填充于柱中)，其孔徑大小的分布與待分離的蛋白質(zhì)分子的大小相當(dāng)。相對較小的蛋白質(zhì)分子可從外圍的溶液中擴散至凝膠中，而較大的分子因其大小的關(guān)系而不能以相同的程度擴散至凝膠中。結(jié)果，根據(jù)大小即可分離蛋白質(zhì)分子，較大的分子比較小的分子先從柱中洗脫出來。蛋白質(zhì)濃度的測定用購自PIERCE的BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒(等同于PIERCE目錄號為23225)測定含蛋白酶的酶產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)濃度。雙辛可寧酸的鈉鹽(BCA)是穩(wěn)定的水溶性化合物，它能與堿性環(huán)境中的一價銅離子(Cu1+)形成深紫色復(fù)合物。BCA試劑形成BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒的基礎(chǔ)，該試劑盒能監(jiān)測蛋白質(zhì)與堿性Cu2+反應(yīng)(Biuret反應(yīng))產(chǎn)生的一價銅離子。此反應(yīng)產(chǎn)生的顏色是穩(wěn)定的，并且隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，而成比例的加深(Smith，P.K.(1985)，AnalyticalBiochemistry，vol.150，pp.76-85)。BCA工作溶液由50份試劑A與1份試劑B混合而成(試劑A是PIERCE目錄號23223，它在堿性的碳酸鹽緩沖液中含有BCA和酒石酸鹽；試劑B是PIERCE目錄號23224，它含有4％CuSO4*5H2O)。將300μl樣品與3.0mlBCA工作溶液混合。于37℃保溫30分鐘，然后將樣品冷卻至室溫，讀出A490值作為樣品中蛋白質(zhì)濃度的測量結(jié)果。在試驗中包括牛血清白蛋白(PIERCE目錄號23209)的稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)。樣品預(yù)-處理如果含蛋白酶的酶產(chǎn)品是固體，首先于5℃將產(chǎn)品溶解于/懸浮于20倍體積的100mMH3BO3，10mM3，3′-二甲基戊二酸，2mMCaCl2，pH6(緩沖液A)至少15分鐘，如果此階段的酶是懸浮液，則流經(jīng)0.45μ的濾器以過濾懸浮液，給出清亮的溶液。從此時起，溶液即被處理成含蛋白酶的液體酶產(chǎn)品。如果含蛋白酶的酶產(chǎn)品是液體，首先于5℃將產(chǎn)品置于6-8000Da截留分子量的SpectraPor透析管(得自SpectrumMedicalIndustries，目錄號為132670)，對著100倍體積的緩沖液A+150mMNaCl(緩沖液B)透析至少5小時，以除去使含蛋白酶的液體酶產(chǎn)品具有高粘度的制劑化合物，所述化合物對大小-排阻層析不利。如果在透析過程中形成沉淀物，則需流經(jīng)0.45μ的濾器以過濾經(jīng)透析的含蛋白酶的酶產(chǎn)品。用上述蛋白質(zhì)濃度測定法測定經(jīng)透析的酶產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)濃度，用緩沖液B稀釋酶產(chǎn)品，得到準(zhǔn)備進行大小-排阻層析的，蛋白質(zhì)濃度為5mg/ml的樣品。如果經(jīng)透析的酶產(chǎn)品的蛋白質(zhì)濃度低于5mg/ml，也可以使用。大小-排阻層析用緩沖液B(流速1ml/min)平衡300mlHiLoad26/60Superdex75pg柱(AmershmPharmaciaBiotech)。將1.0ml含蛋白酶的酶樣品上樣于柱，用緩沖液B(流速1ml/min)洗脫柱。從柱的流出液中收集2.0ml級分，直至所有上樣的樣品都從柱上洗脫下來。通過適當(dāng)?shù)臋z測法分析收集的級分的蛋白質(zhì)濃度(參見上述蛋白質(zhì)濃度測定法)和蛋白酶活性。適當(dāng)檢測法的例子是Suc-AAPF-pNA試驗(參見實施例2B)。其它適當(dāng)?shù)臋z測法是例如CPU試驗(參見實施例1)和ProtazymeAK試驗(參見實施例2D)。調(diào)節(jié)蛋白酶活性試驗的條件，例如pH，以盡可能多地測定經(jīng)分級分離的樣品中的蛋白酶。上文所提及的檢測法的條件是適當(dāng)條件的例子。其它適當(dāng)?shù)臈l件也在上文有關(guān)測定蛋白酶活性的章節(jié)中提到。將一個或多個蛋白酶檢測法中具有活性的蛋白質(zhì)峰定義為蛋白酶峰。蛋白酶峰純度的計算方法為用峰中的蛋白質(zhì)量除以所有被鑒定的蛋白酶峰中的總蛋白質(zhì)量。使用上述方法將含蛋白酶的酶產(chǎn)品純度計算為用酸-穩(wěn)定性蛋白酶峰中的蛋白質(zhì)量除以所有被鑒定的蛋白酶峰中的蛋白質(zhì)量。序列表序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司(F.Hoffmann-LaRocheAG)<120>酸-穩(wěn)定性蛋白酶在動物飼料中的用途<130>10094.204-wo<140>DK200000200<141>2000-02-08<160>2<170>PatentInversion3.0<210>1<211>188<212>PRT<213>擬諾卡氏菌屬菌株(Nocardiopsissp.)NRRL18262<400>1AlaAspIleIleGlyGlyLeuAlaTyrThrMetGlyGlyArgCysSer151015ValGlyPheAlaAlaThrAsnAlaAlaGlyGlnProGlyPheValThr202530AlaGlyHisCysGlyArgValGlyThrGlnValThrIleGlyAsnGly354045ArgGlyValPheGluGlnSerValPheProGlyAsnAspAlaAlaPhe505560ValArgGlyThrSerAsnPheThrLeuThrAsnLeuValSerArgTyr65707580AsnThrGlyGlyTyrAlaAlaValAlaGlyHisAsnGlnAlaProIle859095GlySerSerValCysArgSerGlySerThrThrGlyTrpHisCysGly100105110ThrIleGlnAlaArgGlyGlnSerValSerTyrProGluGlyThrVal115120125ThrAsnMetThrArgThrThrValCysAlaGluProGlyAspSerGly130135140GlySerTyrIleSerGlyThrGlnAlaGlnGlyValThrSerGlyGly145150155160SerGlyAsnCysArgThrGlyGlyThrThrPheTyrGlnGluValThr165170175ProMetValAsnSerTrpGlyValArgLeuArgThr180185<210>2<211>17<212>PRT<213>Nocardiopsisalba<400>2AlaAspIleIleGlyGlyLeuAlaTyrThrMetGlyGlyArgCysSer151015Val權(quán)利要求1.至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶在動物飼料中的用途，其中所述蛋白酶與(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。2.至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶在制備用于動物飼料的組合物中的用途，其中所述蛋白酶與(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。3.權(quán)利要求1的用途，其中蛋白酶的劑量是每kg飼料0.01-200mg蛋白酶酶蛋白質(zhì)。4.權(quán)利要求2的用途，其中所需蛋白酶的劑量是每kg飼料0.01-200mg蛋白酶酶蛋白質(zhì)。5.改善動物飼料營養(yǎng)價值的方法，其中在該飼料中添加至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶，且其中所述蛋白酶與(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。6.動物飼料添加劑，其含有(a)至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質(zhì)，和/或(e)至少一種宏量礦物質(zhì)；其中所述蛋白酶與(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。7.權(quán)利要求6的動物飼料添加劑，其中蛋白酶的量相當(dāng)于每kg飼料需添加0.01-200mg蛋白酶蛋白質(zhì)。8.權(quán)利要求6-7中任一項的動物飼料添加劑，其進一步含有植酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，和/或β-葡聚糖酶。9.動物飼料組合物，其粗蛋白含量為50-800g/kg，且含有至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶，其中所述蛋白酶與(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。10.權(quán)利要求9的動物飼料組合物，其中蛋白酶的量為每kg飼料0.01-200mg蛋白酶蛋白質(zhì)。11.處理植物蛋白質(zhì)的方法，包括在至少一種植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源中添加至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶的步驟，其中所述蛋白酶與(i)SEQIDNO1和/或(ii)SEQIDNO2具有至少70％的同一性。12.權(quán)利要求11的方法，其中至少一種植物蛋白質(zhì)來源中包括大豆。全文摘要與得自擬諾卡氏菌屬菌株的蛋白酶同源的酸－穩(wěn)定性蛋白酶，它們在含有所述蛋白酶的動物飼料，飼料－添加劑和飼料組合物中的用途，以及使用所述蛋白酶處理植物蛋白質(zhì)的方法。文檔編號A23K1/18GK1398162SQ0180470公開日2003年2月19日申請日期2001年2月5日優(yōu)先權(quán)日2000年2月8日發(fā)明者彼得·R·奧斯特加爾德,卡斯滕·肖霍姆申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司