專利名稱：用于治療性克隆的人體細胞組織器官保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及凍存技術(shù)，尤其是人體細胞組織器官(如臍帶組織和臍帶相關(guān)細胞)的體外凍存技術(shù)，其中凍存的細胞被用于治療性克隆及其它用途。通過本發(fā)明的凍存技術(shù)，凍存的組織和細胞可以在復(fù)蘇使用前無限期保存。當(dāng)凍存的組織和細胞被復(fù)蘇后，可用于治療性克隆和移植、功能基因組學(xué)研究、疾病相關(guān)基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料。
目前，生物材料的儲存時間是由生物材料降溫至冷凍保存溫度的過程所決定的。降溫過程中細胞內(nèi)外的水分從液體狀態(tài)到固體狀態(tài)要經(jīng)歷結(jié)冰過程，包括水分子的有序排列——結(jié)晶化或非結(jié)晶化過程。對于冷凍學(xué)家而言，其技術(shù)關(guān)鍵在于使細胞進入冷凍溫度后仍能使其回到生理狀態(tài)而沒有損傷。
細胞和組織凍存的兩個關(guān)鍵步驟是凍融和結(jié)晶。凍融技術(shù)要求細胞外液體結(jié)冰，但采用了很多步驟來減少細胞內(nèi)結(jié)冰。有人建議采用全樣本凍存，但仍無法防止細胞內(nèi)結(jié)冰，正是這些冰晶在凍融中對細胞造成致命的損傷。另一技術(shù)是結(jié)晶技術(shù)，其中試圖采用高濃度液體和/或多聚體來減少冰晶形成。然而長久地暴露于高濃度甚至毒性水平的結(jié)晶添加劑中對細胞的損害亦很大。
在人體的各種細胞組織器官中，臍帶組織和臍帶相關(guān)細胞一直被認為是生物學(xué)廢物，在胎兒出生后予以廢棄，盡管有些臍帶組織和臍帶相關(guān)細胞可作為人體細胞來源而用于體外研究，但通常為短期研究。并沒有將臍帶組織和臍帶相關(guān)細胞經(jīng)過凍存，解凍后再用于研究的報道。
近年來，隨著體細胞克隆技術(shù)、治療性器官克隆和同種或異種移植技術(shù)的發(fā)展和成功，要求一種能長期保存臍帶組織和臍帶相關(guān)細胞的方法，確保臍帶組織和臍帶各種細胞在長期乃至無限期的保存后能安全復(fù)蘇，并且保持其理化性質(zhì)不變，以便為臍帶提供者本人或他人提供器官克隆、移植、功能基因組學(xué)研究、疾病相關(guān)基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料所用。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種對用于治療性克隆的人體細胞組織器官進行凍存的方法，用該方法進行凍存的人體細胞、組織和器官，在解凍后能安全復(fù)蘇并且保持理化性質(zhì)不變，從而用于各種用途如制備治療性克隆。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種對用于治療性克隆的人體細胞、組織或器官進行凍存的方法，該方法包括以下步驟(a)將獲取的人體細胞、組織或器官浸入冷凍保護液，充分混勻冷凍保護液，使冷凍保護液充分滲透入該細胞、組織、器官；(b)起始溫度設(shè)為20±5℃，以5-15℃/分鐘降溫至5-8℃，然后持續(xù)15-30分鐘，進行點冰；(c)點冰以后，維持5±3分鐘以使冷凍溫度仍保持在5-8℃；(d)調(diào)整降溫速度至-0.5至-1.5℃/分鐘并將溫度降至-8±1℃，維持30±20分鐘；(e)以-0.1至-0.5℃/分鐘的速度下降至低于-70℃的保存溫度。
較佳地，步驟(b)-(e)是在CO2緩沖環(huán)境中進行；而且，用液氮冷卻的金屬探棒點冰而形成細胞外點冰。較佳地，在冰晶形成后，溫度以每分鐘0.5至1.5℃(如1度)的速度下降至約-8℃，并保持10-50分鐘以保證冷凍組織進入冷凍狀態(tài)之前，在冷凍保護液中達到物理和生物學(xué)平衡狀態(tài)。
本發(fā)明還提供了將凍存的人體細胞、組織、器官解凍，用于制備治療性克隆供核的方法，它包括將上述凍存的人體細胞組織器官在1-3分鐘內(nèi)快速解凍，然后在體外培養(yǎng)用作供核。
在生物材料的凍存過程中，冷凍保護劑起的作用是保護結(jié)冰過程中細胞的活性。冷凍保護劑的主要通過以下方式起到保護作用，即當(dāng)水轉(zhuǎn)變成冰且鹽離子濃度升高時，起稀釋作用。結(jié)冰量取決于溫度和溶液組分。另外，冷凍保護劑還能降低細胞內(nèi)的結(jié)冰溫度、穩(wěn)定細胞膜和蛋白。
所有的溶液在形成冰晶核心之前都能在低于其冰點的溫度下過冷而不凍結(jié)。當(dāng)用凍融法凍存時，細胞外介質(zhì)的凍結(jié)出現(xiàn)在過冷低點時的點冰。非點冰引起的結(jié)冰是在溶液溫度大大地低于冰點時的自發(fā)結(jié)冰。因為該過程是自發(fā)的，結(jié)冰隨機發(fā)生于無法預(yù)見的溫度下，因此在同樣的凍存程序下細胞的存活力差異很大。
另外，當(dāng)極度過冷時發(fā)生的快速結(jié)冰易造成細胞和組織損傷。另外，如果細胞外結(jié)冰發(fā)生極度過冷時，細胞內(nèi)冰形成的可能性大大增加。這一現(xiàn)象源于結(jié)冰導(dǎo)致的細胞脫水延遲發(fā)生，進一步增加細胞內(nèi)水的潴留，從而使細胞內(nèi)結(jié)冰的可能性又大大地增加了。
一旦細胞外點冰完成，樣品被冰包圍，樣品就能降溫至凍存狀態(tài)。
降溫步驟是凍融法中的關(guān)鍵點。部分結(jié)冰的細胞外溶液濃度高于細胞內(nèi)溶液，為達到熱力學(xué)平衡，細胞丟失水分而脫水。隨著細胞外冰的逐漸增多，脫水愈加嚴(yán)重。細胞的三個特性決定其脫水的速度(1)細胞膜的水滲透率(水滲透率愈差，細胞脫水的時間愈長)；(2)細胞膜水滲透率的溫度依賴性(所有細胞膜在溫度降低時其水滲透率下降)；(3)細胞的大小(大細胞比小細胞需要更長的時間發(fā)生脫水)。由于各細胞的特性各不相同，其凍存的優(yōu)選條件就有一定的差異。
盡管，凍存時細胞損傷的確切機制尚未完全闡明，然而通過細胞活力測定發(fā)現(xiàn)，非常快和非常慢的冷卻速度都大大地降低細胞活力，中等冷卻速度產(chǎn)生最優(yōu)選的結(jié)果。盡管對于不同的細胞，其優(yōu)選冷卻速度和降溫曲線可以差別很大，但冷凍的總體程度是相近的。過快冷凍細胞沒有足夠的時間脫水而形成細胞內(nèi)冰，細胞損傷主要歸因于細胞內(nèi)冰。過慢冷凍時，細胞損傷主要因為過長時間暴露于高濃度的細胞內(nèi)和細胞外的鹽分以及冷凍保護液，或細胞外冰和細胞之間的相互作用。
在細胞內(nèi)冰核形成之前必須使細胞脫水。當(dāng)細胞在1M和2M濃度的冷凍保存液內(nèi)時，細胞脫水這一事件多發(fā)生在-50℃-40℃之間。值得一提的是，細胞內(nèi)的結(jié)冰量在降溫中可能不會對細胞造成傷害，但如果解凍不夠快的話，細胞會因為溶解時發(fā)生腫脹而死亡。
利用本發(fā)明的組織和細胞冷凍方法，可以在低溫下避免細胞內(nèi)冰晶形成和細胞毒性化學(xué)試劑的使用，利用程序冷凍儀在適當(dāng)降溫速度下進行冷凍保護組織。該組織和細胞的冷凍保存方法使組織和細胞能無限期保持其活力和生理特性，以供器官克隆、移植、體外檢測以及其他功用方面的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的對用于治療性克隆的人體細胞組織器官進行凍存的方法，包括步驟(a)將獲取的人體細胞、組織或器官浸入冷凍保護液，充分混勻冷凍保護液，使冷凍保護液充分滲透入該細胞、組織、器官；(b)起始溫度設(shè)為20±5℃，以5-15℃/分鐘降溫至5-8℃，然后持續(xù)15-30分鐘，進行點冰；(c)點冰以后，維持5±3分鐘以使冷凍溫度仍保持在5-8℃；(d)調(diào)整降溫速度至-0.5至-1.5℃/分鐘并將溫度降至-8±1℃，維持30±20分鐘；(e)以-0.1至-0.5℃/分鐘的速度下降至低于-70℃的保存溫度。
適用于本發(fā)明方法的人體細胞組織器官可以是任何的人體細胞、組織和器官，其中包括(但并不限于)臍帶相關(guān)細胞、皮膚細胞、乳腺細胞、輸卵管細胞、耳細胞、卵巢細胞、上皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、卵丘細胞、肌肉細胞、神經(jīng)細胞、成骨細胞；臍帶組織、皮膚、乳腺等。
在本申請中，“臍帶相關(guān)細胞”指來源于臍帶的各種細胞，包括消化后體外培養(yǎng)的臍帶組織的各種細胞，如血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞等。“臍帶組織”指臍帶的全部組織，包括小段、切片等。
在本發(fā)明方法中，凍存溫度一般為低于-70℃，較佳地為不大于-120℃，更佳地為不大于-140℃，最佳地為不大于-196℃。如為短期保存(運輸途中)可置于-76℃(干冰的溫度)。長期保存時，溫度宜更低，例如采用液氮保存(-196℃)。
適用于本發(fā)明方法的冷凍保護液包括細胞滲透性晶體形成試劑或非細胞滲透性的晶體形成試劑合適的細胞滲透性晶體形成試劑的例子包括(但并不限于)丙二醇、乙二醇、二甲亞砜、甘油，較佳地是甘油。非細胞滲透性的晶體形成試劑的例子包括(但并不限于)高分子量復(fù)合糖比如硫酸軟骨素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或羥乙基淀粉等。
通常，冷凍保護液被稀釋于稀釋劑中。合適的稀釋劑例子包括磷酸緩沖液和細胞培養(yǎng)液如DMEM、IDMEM、MEM、M199、RPMI1640、Ham′s F-10、NCTC109、NCTC135培養(yǎng)液、或以上稀釋劑的混合物。較佳地，該稀釋劑是DMEM培養(yǎng)液。為了在凍融過程中保持最佳的細胞活力，冷凍保護液和稀釋劑可根據(jù)各個不同的細胞加以調(diào)整。
一種優(yōu)選的冷凍保護溶液是稀釋于DMEM培養(yǎng)液的1.5M到2.5M甘油，最好是2M的甘油。
在本發(fā)明的一個實例中，冷凍保護劑為1.5-2.5M甘油稀釋于DMEMF培養(yǎng)基中；冷凍組織，細胞浸入冷凍保護液時在20℃中完成，然后，降低溫度從20℃至6℃。降溫速度為-5至-15℃/分鐘。
在將細胞組織樣品與冷凍保護溶液混勻時，可使用任何機械攪動方式進行，從而增強冷凍保護液的滲透性。合適的混勻方法例子包括振蕩、水平搖動、離心、真空泵抽吸等。通常，要有足夠的時間以保證冷凍保護液的充分滲透，因此混勻時間通常為1-4小時。較佳地為2-3小時。
當(dāng)稀釋冷凍保護液的培養(yǎng)基為碳酸氫鈉緩沖體系，較佳地可采用CO2緩沖環(huán)境，因為在冷凍保護液滲透入組織和細胞的滲透過程中，需要CO2緩沖環(huán)境以確保溶液的酸堿度穩(wěn)定。CO2緩沖環(huán)境中的CO2的具體含量可根據(jù)不同的組織和細胞加以調(diào)整，以期保持最佳的細胞活力。通常，CO2濃度為含5％或10％或更高。
在本發(fā)明方法中，宜先將樣品溫度從室溫降至約-5℃至-10℃。這是可采用快凍或慢凍程序，較佳地是降溫速度為5-12℃/分鐘，更佳地降溫速度為8-10℃/分鐘。
在點冰以促發(fā)冰晶形成時，可用液氮冷卻的金屬探針接觸裝有組織或細胞的凍存管，也可直接接觸管內(nèi)的冷凍保護液或通過冷凍室內(nèi)的機械臂操作，也可在冷凍室內(nèi)注入氟立昂或干冰進行點冰。
在點冰之后的降溫過程中，宜采用慢凍程序，即降溫速度低于0.1-0.5℃/分鐘，更佳地降溫速度為0.2-0.5℃/分鐘，更佳地降溫速度為0.2-0.4℃/分鐘，最佳地降溫速度約為0.2-0.3℃/分鐘。
在溶解凍存組織或細胞時，宜以較高速度升溫，在1-3分鐘內(nèi)將溫度升至37℃。一種解凍方法是將凍存管直接置入37℃水浴。也可采用其他直接而快速的加熱方法。
在解凍后，為避免冷凍保護液在常溫下對細胞的毒性作用，須在解凍后15分鐘內(nèi)，最好是在解凍后立即去除冷凍液。
解凍后的組織或細胞，可用于制備治療性克隆，以及作為功能基因組學(xué)研究，疾病相關(guān)基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料。
下面結(jié)合實施例進一步詳細地描述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實施例僅用于闡述目的而不用于限制本發(fā)明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人臍帶組織和臍帶相關(guān)細胞的凍存將臍帶組織浸入至少等量的冰上預(yù)冷的2.0M甘油的DMEM培養(yǎng)基凍存保護液中，持續(xù)1-2小時?；蛘撸瑢⒛殠?nèi)皮細胞的懸浮液與等量的冰上預(yù)冷的同上凍存保護液，持續(xù)0.5小時。期間充分混勻冷凍保護液，可置于CO2緩沖環(huán)境中，以50-70rpm搖床搖勻，或在管中輕輕震搖。
然后移入凍存管并真空封口。凍存管置入程序冷凍儀(Planer)，起始溫度設(shè)為20℃，以5-15℃/分鐘降溫至6℃，然后持續(xù)20分鐘，接著進行點冰。持續(xù)20分鐘以確保整體組織溫度一致(至少要維持15分鐘)，為6℃。點冰的接觸點在冷凍管的液面以下。
點冰以后，維持5分鐘以使冷凍室內(nèi)溫度仍保持在6℃。調(diào)整降溫速度至-1℃/分鐘并將溫度降至-8℃，維持30分鐘。然后以-0.3℃或更慢速度下降至預(yù)定的保存溫度，可以是-70℃，也可以是更低溫度如為-120℃或-140℃下，則對細胞的損傷較小。
凍存組織(或細胞)從程序冷凍儀中移入-196℃冷凍庫或冷凍室內(nèi)保存，直至使用。
實施例2人臍帶組織和臍帶相關(guān)細胞的凍存樣品的解凍凍存組織溶解要求在1-3分鐘內(nèi)快速完成。在該實施例中，將含人臍帶組織和臍帶相關(guān)細胞的凍存樣品的凍存管直接置入37℃水浴，或其他直接而快速的加熱方法。
解凍后，立即用1000rpm離心10分鐘的方法，去除冷凍液。
實施例3人臍帶內(nèi)皮細胞進行體細胞克隆1、獲得供核的人臍帶內(nèi)皮細胞將實施例2或者直接培養(yǎng)獲得的人臍帶內(nèi)皮細胞，用M199或RM1640等培養(yǎng)液(加10％胎牛血清)培養(yǎng)，傳代，遺傳分析，冷凍保存或直接作供核。
2、奶山羊超排與寄母羊同步奶山羊超排每只動物肌注PG,0.06-0.1mg/次，間隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后開始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg計(不同種動物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時。間隔24小時發(fā)情時注射LRH,25ug/次，根據(jù)羊的體重作適當(dāng)調(diào)整。
寄母羊的同步為與提供卵母細胞胞質(zhì)的供質(zhì)母羊同步，受體母羊間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質(zhì)母羊超排注射PG前24小時，受體也同時注射PG，受體注射LRH的時間及劑量同供體。
3、卵母細胞的回收奶山羊注射LRH后28-30小時后手術(shù)回收卵母細胞。按手術(shù)常規(guī)剪毛、消毒、打開腹腔、拉出子宮與輸卵管，用10ml針筒7號針頭，沖卵液為含5％BSA的F10培養(yǎng)液，沖出輸卵管內(nèi)的卵子接于園杯內(nèi)。在體視解剖鏡下，將卵母細胞檢出置于CZB培養(yǎng)液中，37℃,5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4、卵母細胞去核與注射人的體細胞將卵母細胞移于含7.5ug/ml細胞松弛素B的CZB培養(yǎng)液中20min，再移至CZB(含20mM HEPES)培養(yǎng)液中，同時將已消化成球形的臍帶內(nèi)皮細胞或成纖維細胞亦移至該液中。按常規(guī)將卵母細胞去核，去核后再將人的臍帶內(nèi)皮細胞直接注入卵母細胞的胞質(zhì)內(nèi)，形成的細胞被稱之為重構(gòu)卵。重構(gòu)卵置于CZB液中培養(yǎng)30分鐘，然后激活。
5、激活與包埋重構(gòu)卵于CZB+細胞松弛素B(7.5μg/ml)+離子霉素(10μm)中，37℃培養(yǎng)5分鐘。移至CZB+細胞松弛素B(7.5μg/ml)+6-DMAP(2μm)370C，液滴法培養(yǎng)2-6小時。激活后的重構(gòu)卵移至CZB中，待包埋。
包埋采用雙層包埋。所用的包埋液是0.8％與1.0％瓊脂糖(低熔點膠，約40℃)溶液。該包埋液是這樣制備的在10ml錐形玻璃離心管內(nèi)將適量的瓊脂糖與生理鹽水混合煮沸，至完全溶解后置于42℃，水浴待用。
包埋時，在一塑料平皿中加入含Ca2+、Mg2+的PBS液，在PBS液底部用吸管加入胎牛血清，將待包埋的卵母細胞移入血清層，使其自然下沉，待位于底壁，吸出。然后移入另一含剛倒出的0.8％瓊脂糖的小平皿中，將卵母細胞的位置移動2-4次(起到洗滌作用)，再均勻吸卵(卵與卵之間有一定的距離，但相靠不是太遠)，移至PBS中。讓其自然凝固，再分割，換一口徑稍大的吸管，按相同方法進行第二層包埋，不同點在于包埋液的瓊脂糖濃度為1.0％。
6、移植與回收應(yīng)用手術(shù)的方法，將包埋后的重構(gòu)卵吸入移卵管，從輸卵管喇叭口處插入移卵管，將卵移進輸卵管內(nèi)。隨后在輸卵管與子宮連接部用縫線結(jié)扎。在體內(nèi)培養(yǎng)6天后，剪下輸卵管，用培養(yǎng)液沖出胚胎，觀察胚胎發(fā)育情況。
7、發(fā)育胚胎檢驗與保存采用PCR方法對發(fā)育的胚胎進行驗證，即該胚胎是否是來自人體細胞。方法如下從發(fā)育至桑椹或囊胚的胚胎取其部分細胞進行PCR檢測，所用的隨機單引物(10bp)的序列為5′-ACCCCCGAAG-3′，PCR反應(yīng)程序是先94℃4分鐘，然后94℃10秒→36℃15秒→72℃30秒(共40個循環(huán))，最后是72℃4分鐘。
發(fā)育至囊胚的胚胎的保存可利用其內(nèi)細胞團細胞進行體外培養(yǎng)，建立ES細胞；或者將發(fā)育的胚胎液氮冷凍保持備用。結(jié)果如下(一)超數(shù)排卵
1、超排奶山羊總數(shù)20只2、奶山羊超排效果卵巢發(fā)育率(以卵巢直徑＞1cm計)85％(17/20)平均每只奶山羊排卵數(shù)11.2枚(225/20)平均每只奶山羊回收卵數(shù)11.7枚(235/20)回收卵效率104％(235/225)(在計排卵點數(shù)時有誤，有的幾個排卵點緊靠在一起)(二)受體同步發(fā)情通過PG處理后，羊的同步率為78％(20/26)。
(三)體細胞培養(yǎng)建立嬰兒臍帶內(nèi)皮細胞或成纖維細胞系。在傳代供過程中進行了染色體數(shù)分析。觀察了100分裂相，2倍體(46條染色體)占75％。
本試驗所用的人體細胞是臍帶內(nèi)皮細胞或臍帶成纖維細胞，未進行冷凍與饑餓處理。
(四)卵母細胞去核與注射人的體細胞去核總卵數(shù)153枚，其中成活148枚，成活率96.7％體細胞注射后成活卵數(shù)133枚重構(gòu)卵存活率89.8％(五)重構(gòu)胚發(fā)育情況重構(gòu)胚早期發(fā)育情況表
結(jié)果表明，將人嬰兒臍帶內(nèi)皮細胞移植入去核卵母細胞的發(fā)育率達到75.5％，正常發(fā)育率達到60.2％。
(六)發(fā)育胚胎的驗證用發(fā)育胚胎的細胞與山羊胚胎(囊胚)的DNA，分別進行隨機引物PCR分析，其檢測結(jié)果見
圖1，其中g(shù)oat1和2分別為莎能奶山羊細胞、和本地山羊細胞，human1和human2為來自2個治療性克隆植入前胚胎的細胞。
結(jié)果表明，發(fā)育胚胎的細胞的兩個樣品間是一致的，兩種山羊囊胚間亦是一致的；而山羊囊胚與發(fā)育胚胎(其基因組來自人體細胞)之間的差別是很明顯的。因此，這證實發(fā)育胚胎來自人，即胚胎細胞中含有的是人的染色體和基因組。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1．一種對用于治療性克隆的人體細胞、組織或器官進行凍存的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)將獲取的人體細胞、組織或器官浸入冷凍保護液，充分混勻冷凍保護液，使冷凍保護液充分滲透入該細胞、組織、器官；(b)起始溫度設(shè)為20±5℃，以5-15℃/分鐘降溫至5-8℃，然后持續(xù)15-30分鐘，進行點冰；(c)點冰以后，維持5±3分鐘以使冷凍溫度仍保持在5-8℃；(d)調(diào)整降溫速度為-0.5至-1.5℃/分鐘并將溫度降至-8±1℃，維持30±20分鐘；(e)以-0.1至-0.5℃/分鐘的速度下降至低于-70℃的保存溫度。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)-(e)是在CO2緩沖環(huán)境中進行；而且，用液氮冷卻的金屬探棒點冰而形成細胞外點冰；
3．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，冰晶形成后，溫度以每分鐘1度的速度下降至-8℃，并保持10-50分鐘以保證冷凍組織進入冷凍狀態(tài)之前，在冷凍保護液中達到物理和生物學(xué)平衡狀態(tài)。
4．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，人體細胞組織器官選自下組臍帶相關(guān)細胞、皮膚細胞、乳腺細胞、輸卵管細胞、耳細胞、卵巢細胞、上皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、卵丘細胞、肌肉細胞、神經(jīng)細胞、成骨細胞；臍帶、皮膚、乳腺。
5．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，凍存狀態(tài)的溫度為不高于-120℃。
6．如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，凍存狀態(tài)的溫度為不高于-140℃。
7．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，冷凍保護液含有細胞滲透試劑、晶體形成試劑或非晶體形成試劑，并且稀釋于選自下組的培養(yǎng)基或介質(zhì)中DMEM、IDMEM、MEM、M199、RPMI1640、Ham′s F12、Ham′s F10、NCTC109、NCTC135或磷酸緩沖鹽。
8．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，細胞滲透試劑、晶體形成試劑或非晶體形成試劑選自下組硫酸軟骨素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙二醇、羥乙基淀粉、甘油、丙二醇、乙烯乙二醇、二甲亞砜。
9．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，冷凍保護劑為1.5-2.5M甘油稀釋于DMEMF培養(yǎng)基中；冷凍組織，細胞浸入冷凍保護液時在20℃中完成，然后，降低溫度從20℃至6℃，降溫速度為-5至-15℃/分鐘。
10．如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將凍存的人體細胞組織器官解凍，用于制備治療性克隆的供核，其步驟包括在1-3分鐘內(nèi)快速解凍，然后在體外培養(yǎng)用作供核。
全文摘要
本發(fā)明涉及對人活細胞、活組織和活器官以及原代細胞、繼代細胞和細胞株的體外保存技術(shù)。它包括將人各種組織細胞浸入冷凍保護液,與冷凍保護液充分混勻,冷凍保護液有效地滲透入組織,分階段地將溫度降至預(yù)定溫度。冷凍組織細胞在使用前可無限期保存?？捎糜谥委熜云鞴倏寺〉墓w細胞或細胞核。此外凍存的人體組織,細胞解凍復(fù)蘇后體外培養(yǎng)可作為功能基因組學(xué)研究,疾病相關(guān)基因篩選以及篩選有生物活性的化合物的原料。
文檔編號A01N1/02GK1302542SQ00111408
公開日2001年7月11日 申請日期2000年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月3日
發(fā)明者成國祥 申請人:上海中路生物工程有限公司